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- 产品名称：高纯度无内**质粒大提试剂盒（沉淀法）
- 产品型号：PD1516-02
- 产品展商：Biomiga
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- 发布时间：2013-01-12
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简单介绍
高纯度无内**质粒大提试剂盒（沉淀法）（High Pure Endotoxin free Plasmid Maxi kit）在PD1513的基础上，采用独特的Endoclean Buffer可从质粒中去除内**，操作简便，重复使用可使内**含量低于0.1EU/μg质粒。
产品描述
高纯度无内**质粒大提试剂盒（沉淀法）（High Pure Endotoxin free Plasmid Maxi kit）采用独特的Endoclean Buffer可从质粒中去除内**，操作简便，重复使用可使内**含量低于0.1EU/μg质粒。
高纯度无内**质粒大提试剂盒（沉淀法）组分：
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Catloga#
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PD1516-00
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PD1516-01
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PD1516-02
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Preps
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2
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10
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25
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Buffer A1
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22 mL
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110 mL
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270 mL
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Buffer ER*
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1.2 mL
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5.5 mL
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13 mL
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Buffer B1
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22 mL
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110 mL
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270 mL
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Buffer D1
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2.5 mL
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11 mL
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27 mL
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Buffer N3
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27 mL
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135 mL
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330 mL
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EndoCleanBuffer
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5 mL
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25 mL
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60 mL
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Buffer KB
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22 mL
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110 mL
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270 mL
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RNase A
(20 mg/mL)
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2.2 mg
(110 µL)
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11 mg
(550 µL)
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27 mg
(1.35 mL)
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Endofree Elution Buffer
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6 mL
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30 mL
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60 mL
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User menu
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1
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1
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1
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保存条件：
Buffer A1在加入RNase A后，需放在4°C保存，Buffer ER* 也需于4°C保存。其他所有试剂成分可置于常温下保存（22-25°C），本试剂盒自购买之日起可保存12个月。
EZgeneTM无内**质粒大提异丙醇沉淀法操作步骤：
1、将初摇的100 µL 加入到100 -200 mL的LB培养基（含适量***），37oC震荡培养14-16小时。
2、室温下5,000 x g离心10 min，收集菌体，将上清倒掉，并将收集管倒扣在纸巾上以除去残留在菌体表明的培养基，将上清完全去除。
3、加入 10mL Buffer A1（确保已加入RNase A），用移液枪或涡流震荡充分悬浮**细胞。再向悬浮的菌液中加入0.5 mL 的Buffer ER，反转5-10次，混合均匀。37°C温育10min。
4、加入 9mL Buffer B1, 温和地反转5-10 次以混合均匀，然后静置2-5 min至溶液粘��而澄清，加入1mL Buffer D1，温和地反转5次，静止5 min。
5、加入 2.4 mL Buffer N3, 立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。
6、将离心管转至高速离心机，在室温下 >14,000 x g 离心10 min。
7、小心吸取离心后的上清液至 50 mL 离心管中（避免吸起沉淀），加入0.1倍体积的EndoClean Buffer,，用手迅速颠倒混匀。混匀后冰浴10 min，其间不时摇匀(若EndoClean Buffer粘稠难吸，可将枪头剪掉头后再吸取)。
注：加入EndoClean Buffer后溶液变红并浑浊，冰浴后变清亮。
8、取出后65oC温浴5 min左右，使溶液变浑浊，室温下(务必使溶液温度恢复到23oC以上，否则离心后溶液不分层)，10,000 x g离心5 min（也可在2,500 x g离心15 min)。此时溶液分为两层，上层水相含有质粒，下层红色有机相含有内**。
9、小心将上层水相转移至一个新的50 mL管中（避免吸取下层红色有机相），加入0.1倍体积的3M NaAC (pH=5.2) 或者3M KAC(pH=5.2)和0.7-1倍体积的异丙醇，用手迅速颠倒混匀。
10、4°C ，大于14,000 x g 离心20 min，，这时候将出现质粒DNA沉淀，小心倒去上清，沉淀上残留的上清用枪头吸干。
11、加入5 mL Buffer KB，将沉淀轻轻弹起，室温放置约5 min，4°C 10,000~12,000 x g 离心 5 min，小心倒去上清，沉淀上残留的上清用枪头吸干。
12、加入5 mL 70% 乙醇，将沉淀轻轻弹起，室温放置约5 min，4°C 10,000~12,000 x g 离心 5 min，将上清小心倒出，沉淀上残留的上清用枪头吸干，重复步骤10。
13、4°C 5,000 x g 离心1 min，用枪头将残留的上清吸干。
14、将离心管在空气中风干，或者置于55°C烘箱中 5 min，以彻底去除残留酒精。
15、加入1-1.5 mL Endofree Elution Buffer 或者 ddH2O ，可置于65°C水浴或用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解。
16、16. DNA浓度计算如下：DNA浓度 = 50 μg/mL ×OD260 × {稀释倍数} 注：纯化的质粒的OD260/OD280的比值在1.7-1.9之间，如果用水溶解，OD260/OD280会偏低，但并表示DNA纯度低，因为pH值和离子存在会影响OD比值。
高纯度无内**质粒大提试剂盒（沉淀法）操作流程：
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