位移差分拉曼光谱（SERDS）技术原理

拉曼光谱

众所周知，1928年，印度物理学家拉曼通过相关实验**证明了非弹性散射光的存在。后来的学者以拉曼的名字将这种非弹性散射光命名为“拉曼散射”，与之对应的散射光现象称为“拉曼效应”。之后这种被称为“分子光谱”的光谱技术逐步成为了研究分子结构的重要手段之一。20世纪60年代，激光的出现使得拉曼光谱仪系统得到了很大的简化，检测的灵敏度提高很多，由此开始，拉开了拉曼光谱真正用于常规分析和检测的序幕。

拉曼光谱是在拉曼效应基础上的一种方法，由于其含有的众多优势已成为检测和分析方法中的佼佼者，被广泛应用于食品检测、生物医药、分子结构研究、化工过程、生物化学、考古及文物鉴定以及法学样品分析等各个领域。学术界先后出现了多种常用的拉曼光谱延伸技术，如表面增强拉曼光谱、共焦显微拉曼光谱、傅里叶变换拉曼光谱、共振拉曼光谱等。

拉曼光谱技术因其无需样品制备过程、快速无损、稳定性高的特性，在光学快检领域备受推崇。但是，在拉曼光谱技术拥有众多优点的同时，信号弱和易受干扰的缺陷也成为限制拉曼光谱技术应用的瓶颈。比如大多数食品、药品的拉曼光谱检测过程都伴有强荧光干扰，荧光的存在严重影响拉曼光谱特征峰的识别，越来越多的物质或是因为条件限制无法获取高信噪比的拉曼光谱，或是因为自身强荧光掩盖了原本就很弱的拉曼信号，导致应用受限。

位移差分拉曼光谱（SERDS）技术原理

荧光抑制

目前，抑制荧光干扰的方法有如下几种：

一种简单的方法是加入荧光猝灭剂。但是使用这种方法的时候必须要保证样品不会受到高浓度的荧光猝灭剂干扰，对于生物样品来说，这基本不可能。

另一种方法是使用比低能量吸收带更长的波长激光来激发样品（预共振激发）。利用这一思想的一项重要技术就是傅里叶变换（FT）拉曼光谱。在很多情况下，用这种方式可以获得在高荧光中的拉曼光谱信号，但是这种方法有一些严重的缺陷。首先，这种激发光不会直接与任何的基团发生共振，在多组分样本中就不能实现对特定基团的选择性增强。其次，由于激发光受限于预激发波长，就不能通过吸收带来测量共振拉曼激发的轮廓曲线（拉曼强度是激发波长的函数）。这是一个极其严重的缺陷，因为分析激发光的轮廓曲线对于探测色团的激发电子状态特性是很有用的。

还有一种方法是基于拉曼散射和荧光发射可以在时间上区分开来，使用门控和时间相关的光子计数来提供时间分辨率。该方法涉及到激光强度的高频率调制，不止是激光器的锁模，还用到了外部的调制器来调制激光腔，但是仅在荧光寿命相对较长的时候才有用。

另一种区分拉曼信号和荧光背景的方法是设计激发激光的波长调谐。这种技术通过向一个连续波染料激光器的调谐元件中引入一个低频调制器而得以实现。波长调制技术可应用于任何系统，但其用途受限于对激光波长的低频调制和锁定检测的专用设备。

上述的各种荧光消除技术方法确实发挥了一定作用，但是它们的劣势也是显而易见。

位移差分拉曼光谱

根据Kasha's rule，美国加州大学伯克利分校的研究人员提出了位移差分拉曼方法来解决荧光背景干扰的问题。分子所发射的光（荧光或磷光）只能从某一多重态中的低态激发，因此对于激发光的微小偏移并不影响背景（样品受激发射光谱）。获得的拉曼光谱的荧光轮廓几乎不发生变化。而拉曼光谱作为散射光谱特征峰出现的位置与激发光源频谱位置有固定关系，当激发光频率移动时拉曼特征峰会跟着移动。Johannes Kiefer在文章中用宽谱光源进行光谱成像，很形象的说明了这一现象。图中y代表不同激发频率，颜色谱代表了接收到的光谱强度。对比下面的光谱图，可以看中间有很强的一片区域是中心对称的，代表了不随激发光频率变化的受激发射光谱，而窄窄的倾斜光谱则是拉曼光谱。

位移差分拉曼光谱（SERDS），这种技术基于在两个有轻微偏移的激发激光中收集两张不同的光谱。首先，与以前的技术对比，不需要使用特殊的设备来改变激励激光器的波长。其次，使用多通道检测，从而在给定的信号积分时间内改善了信噪比。对于现在的制冷式非加强CCD探测器，具有非常高的散粒噪声，信噪比对于这种可以简单实现的差分方法是至关重要的。除了这些特性以外，这种方法对于短寿命的和长寿命的荧光样品同样适用。

差分拉曼技术采用物理和数学相结合的荧光处理方法，常规流程如下：

首先，需要获得采用具有已知微小波长错位的光源激发的拉曼光谱。将光谱的基线对齐，理论上对齐后光谱相减生成的曲线中仅包含拉曼光谱的差分信息。根据公式：

可以将差分曲线看作拉曼光谱横轴颠倒后与两个δ函数差的卷积： 

可以对差分曲线积分后，看作拉曼光谱与一个方波函数的卷积，通过解卷积的方式获得真实拉曼光谱。

实际操作中虽然两次差分光谱虽然相差不大，但是由于激光的漂白作用或激光的波动，焦点位置的微小变化等各种因素都可能导致光谱曲线的变化。错误的对齐将在差分拉曼光谱重建过程中被放大，降低拉曼特征提取效果。数学操作上，光谱对齐像一个悖论。我们希望通过光谱对齐通过差分扣除光谱中的荧光部分，分离荧光和拉曼信号；但是只有我们知道准确的荧光才可能让光谱荧光的对齐。而如果我们已经可以清楚的区分荧光和拉曼信号，我们则没有必要对光谱信号进行差分。

为了解决这一问题，常规做法是近似，根据整个光谱面积或关键的局部面积作为基准对谱图进行缩放和平移，使谱图的匹配基本匹配。然后再对差分后产生的曲线进行矫正，如交替小二乘法（ALS）拟合。但是由于拟合目标是未知的，所以该方法还存在很多不确定性。

申贝开发团队采用BP神经网络技术，基于任意函数可以被一个有三层单元的网络以任意精度逼近(Cybenko 1988)这一原理。通过迭代优解的方式，同时将差分、对齐和基线矫正同时完成。实验经过几十次迭代（用时0.2s）可以准确分离差分信号和基线偏差。

目前，位移差分拉曼光谱的应用场景也在积极开发中。

德国Ferdinand Braun研究所的研究人员在瑞士的一个苹果园采用位移差分拉曼光谱技术，克服室外背景阳光以及样品荧光干扰，就苹果皮和苹果树叶进行了SERDS测量，获得了苹果的指纹特征。该团队还基于差分拉曼技术进行了针对人体健康的人体皮肤中胡萝卜素的检测研究，实现了标准样品0.05nmol/g的检出限。

针对红酒中酒精和甲醇的检测，众所周知红酒具有很高的荧光信号，美国和克罗地亚研究人员，通过位移激发差分拉曼技术在谱图中恢复了葡萄酒中乙醇和甲醇的光谱，通过400次平均实现对含量在0.05%甲醇的检测。

申贝开发团队采用785nm，间距1nm的差分拉曼系统，结合团队开发的差分拉曼解调和去噪算法，对弱激发下的样品拉曼特征也进行了相关研究。

科技开发的目的绝不仅仅是技术的更新升级，如何能将技术应用与市场热点需求深入结合，将科技成果转换为社会生产力才是关键。Senbe开发团队推出的位移差分拉曼光谱技术新品突破性的解决了拉曼光谱荧光干扰的问题，进一步优化和完善了拉曼光谱快检性能，拓宽了拉曼光谱的研究和应用领域，对促进拉曼光谱领域的科学技术与理论发展做出了重要贡献。期待Senbe开发团队以及更多的拉曼领域科研工作者通过不懈的努力去探索和发展位移差分拉曼光谱这一新兴技术，将**的拉曼光谱技术转化为科技成果并投入规模化生产，让便携式拉曼检测技术变得更为实用和方便。