塞来昔布联合吉西他滨动脉灌注抑制人肺癌 A549 细胞移植瘤的研究

何 阳，赵保成，刘洪强，王赛博，郑晓辉，曹 军

( 上海市徐汇区大华医院，上海 200237)

［ 摘要］  目的  研究塞来昔布联合吉西他滨经动脉灌注抑制人肺癌 A549 细胞移植瘤的作用。方法  人肺癌 A549 细胞系经传代培养后，移植于 40 只祼大鼠建立肺癌裸大鼠模型。将荷瘤鼠均分为假手术组、吉西他滨组、塞来昔布组、联合组。假手术组动脉注入生理盐水 0． 2 mL。吉西他滨组、塞来昔布组分别经动脉灌注吉西他滨 100 mg / kg 及塞来昔布 25 mg / kg。联合组灌注吉西他滨 100 mg / kg + 塞来昔布 25 mg / kg。观察干预前后各组大鼠肿瘤体积的变化，计算荷瘤鼠的抑瘤率，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，采用 Western blot 法检测各组Bcl － 2 以及 Caspase － 3 表达情况。结果 吉西他滨组、塞来昔布组和联合组的抑瘤率分别为 54． 18% ，49． 52% 和 88． 59% ; 联合组移植瘤组织的 Bcl － 2 表达量均低于其他 3 组( P 均 ＜0． 05) ，Caspase － 3 表达量及凋亡指数均高于其他 3 组( P 均 ＜ 0． 05) 。结论    塞来昔布与吉西他滨动脉灌注都能抑制肺癌裸大鼠移植瘤的生长，二者联合应用效果更好，诱导细胞凋亡是两者协同抗肿瘤作用的机制。

［关键词］ 塞来昔布; 吉西他滨; 动脉灌注化疗; 肺癌doi: 10． 3969 / j． issn． 1008 － 8849． 2015． 32． 003

［中图分类号］  Ｒ － 332 ［文献标识码］   A ［文章编号］ 1008 － 8849( 2015) 32 － 3542 － 04

肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，肺癌患者 5 年的生存率仅为 16． 1% ，在癌症死亡患者中肺癌是男性**死亡因素，是女性第三死亡因素，因此积极探寻有效的**方式成为研究重点［1］。环氧合酶 － 2 ( COX － 2) 不仅能够促进肿瘤血管和**管形成，抑制肿瘤细胞凋亡，而且对促进肿瘤细胞生 长、转移及将前致癌物质转化为致癌物质有主导作用。动物 试验表明，选择性 COX － 2 抑制剂塞来昔布灌胃可抑制裸鼠移植瘤的生长［2］。还有试验报道，第三代化疗药吉西他滨应 用于中晚期肺癌的介入化疗中，不仅能够直接杀灭恶性肿瘤 细胞，同时可抑制肿瘤血管生成，发挥间接抗肿瘤作用，且近 期有效率高于第三代静脉化疗方案［3］。但是关于塞来昔布联合吉西他滨动脉灌注抑制人肺癌 A549 细胞移植瘤的实验研究尚少见，为此笔者以体外实验方法进行了研究，旨在为今 后从分子角度采用此种方式**肺癌奠定基础。

1 实验资料

1. 1   材料    人肺癌 A549( 上海市肿瘤研究所) 。SPF 级裸大鼠 40 只、BALB / C 裸小鼠 4 只( 北京智鼠多宝公司) ，动物合格证 SYXK( 沪) 2007 － 0001，裸大鼠体质量( 180 ± 15) g，8 ～ 10 周龄，雌雄各半; 裸小鼠体质量( 22． 1 ± 2． 1) g，4 ～ 5 周龄，雌雄各半。饲养相对湿度 40% ～ 50% ，温度 22 ～ 25 ℃ ，摄食、饮水自由同等。塞来昔布(  辉瑞公司) ，吉西他滨(  豪森药业) 。Annexin V － FITC / PI 凋亡试剂盒( 上海炎彬化工科技有限公司) ; ECL 试剂盒( BestBIO 公司) ，半胱氨酸蛋白 酶( Caspase)  － 3，B **细胞瘤( Bcl)  － 2，GAPDH  抗体( Santa cruz) ，鼠抗人二抗( 碧云天) 。

1. 2 方 法

1. 2. 1 细胞培养 将人肺癌 A549 细胞复苏，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液培养，取生长良好的细胞用 0． 25% 胰蛋白酶消化、离心，收集细胞用 1 mL 冰 PBS 稀释成 5 × 106 mL － 1 ，以 0． 2 mL 接种于 4 只 BALB / C 裸小鼠右腋皮下( 因为裸小鼠接种成瘤容易，直接用肺癌细胞株接种裸大鼠成瘤困 难，所以先接种裸小鼠，取得足够量肿瘤组织)  ，待肿瘤长至体积约为10 mm × 10 mm × 10 mm 时移植于裸大鼠耳后造模。

1. 2. 2    造模分组    将瘤结无破溃、生长良好的腋下接种荷瘤裸小鼠 4 只处死，无菌条件下剥离瘤结，**坏死组织，在生理盐水中将瘤结反复剪切为 2 mm × 2 mm × 2 mm 大小的瘤组织块，然后接种于裸大鼠右耳后皮下。肿瘤于 8 d 后接种成功，肿瘤生长 3 周后体积 2 650 ～ 2 800 mm3 ，对荷瘤裸大鼠根据性别分层后分为假手术组、吉西他滨组、塞来昔布组、联合 组，每组 10 只。

1. 2. 3    给**法    用 10% 水合氯醛 3． 5 g / kg 腹腔麻醉各组荷瘤大鼠，颈部正中皮肤切开，暴露右颈动脉; 采用改良Seldinger 技术将静脉留置针插入右颈动脉，先在 C 臂机 DSA 下使用稀释的碘克沙醇 0． 2 mL 行手推动脉造影，诊断肿瘤的供血动脉并明确肿瘤的显影情况; 再经导管灌注**或盐水， 缓慢推注，灌注时间 30 s，随后缝合皮肤。假手术组经导管注入生理盐水 0． 2 mL，吉西他滨组予吉西他滨 100 mg / kg 导管灌注，塞来昔布组予塞来昔布 25 mg / kg 导管灌注，联合组予吉西他滨 100 mg / kg、塞来昔布 25 mg / kg 导管灌注。

1. 2. 4     肿瘤体积及抑瘤率测量方法     采用游标卡尺测量肿瘤长短径，肿瘤体积( mm3 )  = 肿瘤长径 × 肿瘤短径2 /2。用药后第16 天处死各组大鼠，取出皮下肿瘤称质量，抑瘤率  = ( 1 － **组瘤质量/ 荷瘤假手术组瘤质量)  × 100% 。计算 Q 值并判断两药的联合效应［4］: 若 E( A + B) 设为两药联用抑瘤率， EA 和EB 为各单药抑瘤率，则 Q = E( A + B) /［EA + ( 1 － EA) × EB］，Q 值 0． 85 ～ 1． 15 提示两药作用相加，Q ＞ 1． 15 提示两药协同，Q ＜ 0． 85 提示两药拮抗。

1. 2. 5 组织检测 取新鲜瘤组织，用 10% 甲醛溶液固定后， 将肿瘤组织制成单细胞悬液，离心去除细胞碎片，收集细胞

( 每组至少1 × 106 个细胞) ，按 Annexin V － FITC / PI 凋亡试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测移植瘤细胞凋亡率。苏木素  － 伊红( HE) 染色检测各组肿瘤细胞形态; Western blot 法检测Bcl － 2 和 Caspase － 3 表达水平: SDS － PAGE 分离胶电泳; 4% SDS － PAGE  浓缩胶电泳。PVDF  膜半干转 100  V，30  min。 5% 脱脂奶粉封闭过夜。一抗 1 ∶ 1 000 过夜，二抗 1 ∶ 5 000 孵育 1 h。按操作试剂盒说明操作。

1. 3    统计学方法    数据处理使用 SPSS 13． 0 统计软件。计量资料以 x珋± s 表示，组间比较采用 t 检验，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 裸大鼠情况  40 只裸大鼠实验完成时均存活，饮水、进食、活动状态良好，各组手术切口**好，均未见感染。

2. 2 各组荷瘤鼠肿瘤体积比较 各组移植瘤**前体积比较差异无统计学意义( P 均 ＞ 0． 05) 。**后，吉西他滨组、塞来昔布组、联合组肿瘤体积均小于假手术组( P 均 ＜ 0． 05) ，吉西他滨组肿瘤体积小于塞来昔布组( P 均 ＜ 0． 05) ，联合组小于吉西他滨组和塞来昔布组( P 均 ＜ 0． 05) 。见表 1。

 2. 3 各组移植瘤质量及抑瘤率比较 吉西他滨组、塞来昔布组、联合组移植瘤质量均明显低于假手术组( P 均 ＜ 0． 05 ) ，联合组明显低于吉西他滨组、塞来昔布组( P 均 ＜ 0． 05) ; 联合组抑瘤率明显高于吉西他滨组、塞来昔布组，其 Q 值 ＞ 1． 15。见表 2。

2. 4   各组 Bcl － 2 和 Caspase － 3 蛋白表达情况 假手术组Bcl － 2 蛋白相对表达量为 1． 20 ± 0． 09，吉西他滨组为 0． 67 ± 0． 15，塞来昔布组为 0． 80 ± 0． 07，联合组为 0． 26 ± 0． 08，联合组 Bcl － 2 表达量明显低于其余 3 组( P 均 ＜ 0． 05) ，吉西他滨组及塞来昔布组明显低于假手术组( P 均 ＜ 0． 05) 。假手术组 Caspase － 3 蛋白相对表达量为 0． 53 ± 0． 05，吉西他滨组为 0 . 99 ± 0 ． 06 ，塞来昔布组为0 ． 87 ± 0 ． 03 ，联合组为1 ． 46 ±0. 18，吉西他滨组及塞来昔布组 Caspase － 3 蛋白表达量明显高于假手术组( P 均 ＜ 0． 05) ，联合组 Caspase － 3 蛋白表达量明显高于其余 3 组( P 均 ＜ 0． 05) 。

 2. 5 各组肿瘤组织 HE 染色表现  假手术组未见明显细胞凋亡表现，见图 1; 吉西他滨组可见凋亡细胞致密浓缩核染色质，凋亡小体形成，核碎裂，可见较多空泡，见图 2; 塞来昔布组可见相应的凋亡表现，见图 3; 联合组上述核碎裂及空泡更加明显，见图 4。