水迷宫-左归降糖解郁方改善糖尿病并发抑郁症大鼠抑郁样行为的作用及其机制

左归降糖解郁方改善糖尿病并发抑郁症大鼠抑郁样行为的作用及其机制

杨 蕙1 ，王宇红2 ，杨  琴2 ， 凌  佳2 ，李  薇1 ，柳  卓2 ， 孟 盼 2 ，刘 检 1

( 1．  湖南中医药大学  **附属医院  中心实验室，长沙    410007;

  2．   湖南中医药大学  湖南省中药粉体与****省部共建国家重点实验室培育基地，长沙 410007)

摘要: 目的 研究左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠抑郁样行为的作用及其对细胞外信号调节蛋白激酶信号通路调节的影响。方法 依次给予 SD 大鼠高脂乳剂灌胃与链脲佐菌素尾静脉注射和慢性不可预知应激的方法，建立糖  尿病并发抑郁症动物模型。按照体重将大鼠随机分为 5 组: 模型组、对照组( 0. 18 g·kg － 1 二甲双胍 + 1. 8 mg·kg － 1 氟西汀) 、高中低 3 个剂量实验组( 左归降糖解郁方: 20. 52，10. 26，5. 13  g·kg － 1 ) ，给药体积均为 10  mL·kg － 1 ，连续给药 4 周; 另设正常大鼠为正常组。用开野实验检测各组大鼠抑郁行为，用水迷宫实验检测大鼠的学习记忆功能，用蛋白质**印迹法检测大鼠海马小鸟苷酸三 磷酸结合蛋白( Ｒas) 、细胞外信号调节激酶 1 /2 ( EＲK1 /2 ) 及其磷酸化蛋白p － EＲK1 /2、环磷酸腺苷反应单元结合蛋白( CＲEB) 及其磷酸化蛋白 p － CＲEB 的表达。结果 中药干预后，在开野实验中的活动次数: 正常组、模型组和高剂量实验组分别是( 47. 50 ± 15. 81) ，( 7. 50 ± 5. 24) ，( 21. 88 ± 14. 47)   次，与正常组比较，模型组差异有统计学意义( P ＜ 0. 01) ; 与模型组比较，高剂量实验组差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) 。在水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期回归直线方程: 正常组、模型组和高剂量实验组分别为 y = 66. 88  － 10. 76x，y = 63. 56  － 5. 964x， y = 67. 75 － 9. 51x，与正常组比较，模型组差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) ，与模型组比较，高剂量实验组差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) 。这 3 组的探索时间分别为( 36. 63 ± 13. 39) ，( 22. 25 ± 5. 42) ，( 30. 75 ± 7. 92)   s，与正常组比较，模型组差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) ; 与模型组比较，高剂量实验组大鼠差异有统计学意义( P ＜ 0. 05 ) 。正常组、模型组和高剂量实验组的 Ｒas 表达灰度值分别为0. 70 ± 0. 06，0. 08 ± 0. 03，0. 52 ± 0. 08，这 3 组的 p － EＲK1 / EＲK1 的比值分别为0. 62 ± 0. 10，0. 20 ± 0. 03，0. 41 ± 0. 02，这 3 组的 p － EＲK2 / EＲK2 的比值分别为0. 40 ± 0. 09，0. 29 ± 0. 09，0. 32 ± 0. 10，这 3 组的 p － CＲEB / CＲEB 的比值分别为0. 60 ± 0. 10，0. 10 ± 0. 02，0. 46 ± 0. 08。与正常组比较，模型组差异均有统计学意义( 均 P ＜ 0. 01 ) ; 与模型组比较，高剂量实验组差异均有统计学意义( 均 P ＜ 0. 01) ; 中低 2 个剂量实验组仅 p － CＲEB / CＲEB 比值差异有统计学意义( P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05) 。结论   左归降糖解郁方可能通过有效调控 EＲK 信号通路、激活 CＲEB，从而改善糖尿病并发抑郁症大鼠的抑郁样行为。

关键词: 左归降糖解郁方; 糖尿病并发抑郁症; 小鸟苷酸三磷酸结合蛋白; 细胞外信号调节激酶 1 /2; 环磷酸腺苷反应单元结合蛋白DOI: 10. 13699 / j. cnki. 1001 － 6821. 2017. 21. 021中图分类号: Ｒ975 文献标志码: A文章编号: 1001 － 6821( 2017) 21 － 2167 － 04据统计，无论是 1 型还是 2 型糖尿病，每 4 人中就有 1 人有明显的抑郁症状［1］。环磷酸腺苷反应元件结合蛋白( CＲEB) 的表达与抑郁症密切相关。糖尿病大鼠脑内 CＲEB 及其磷酸化蛋白的表达水平显著下调，且与大鼠的学习、记忆损伤呈负相关［2］。脑组织中的细胞外信号调节蛋白激酶( EＲK1 /2) 信号通路激活，可刺激转录因子 CＲEB 磷酸化，从而调控多种蛋白基因的表达 并影响大鼠的空间记忆能力 。前文［4］研究结果显示，左归降糖解郁方可显著增加糖尿病并发抑郁症大鼠海马脑源性神经营养因子( BDNF) 的表达。因此，本实验拟研究左归降糖解郁方的抗抑郁作用及其对 Ｒas － EＲK1 /2 － CＲEB 信号通路的调控作用。

材料与方法

1 材料

动物    SPF 级雄性 SD  大鼠，180 ～ 220  g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。动物许可证号: SCXK( 湘) 2013 － 0004。药品与试剂 左归降糖解郁方( ZJJP: 由黄芪 18g、贯叶连翘 3 g、姜黄 9 g、熟地黄 15 g、山茱萸 12 g、枸杞 12 g、菟丝子 9 g、杜仲 9 g、丹参 12 g、丹皮 6 g、牛膝9 g 组成) ，原材料由湖南中医药大学**附属医院药剂科提供，提取液相当于生药量为 1. 14 g·mL ^{－ 1} ; 盐酸二甲双胍片，规格: 每片 0. 25  g，批号: 150123，湖南湘雅制药有限公司生产; 盐酸氟西汀胶囊( 商品名: 百忧解) ，规格: 每粒 20  mg，批号: SS41A，购自法国 Patheon公司; 链脲佐菌素( STZ) ，规格: 每支 100mg，批号: 1122F031，购自北京索莱宝公司。小鸟苷酸三磷酸结合蛋白( Ｒas) 、EＲK1 /2 及其磷酸化蛋白 p － EＲK1 /2、CＲEB 兔抗大鼠多克隆抗体，购自美国 Cell Signaling公司; EＲK1 /2 兔抗大鼠多克隆抗体，购自美国 Proteintech 公司; 兔抗IgG － HＲP，购自北京中杉金桥; Protein ECL 高敏化学发光试剂盒，购自杭州联科生物技术有限公司。

仪器 Open － field 敞箱，购自美国东乐自然基因生命科学公司; Morris 水迷宫，购自北京智鼠多宝生物科技有限责任公司; 电泳仪，购自美国 BIO － ＲAD 公司。

2 实验方法

2. 1 建立糖尿病并发抑郁症动物模型［4］SD 大鼠灌胃给予高脂乳剂 14  d 后，尾静脉注射STZ 溶液 38  mg· min ^{－ 1} 。对照组给予等量柠檬酸缓4 ℃ 下、以 1. 2 × 10⁴ r·min ^{－ 1} 离心 20 min。测定总蛋白含量。按照文献方法进行操作。磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白均用TBST 洗3 次，每次10 min，用 ECL 化学发光法进行检测。

3 统计学方法

数据分析采用  SPSS16. 0  统计软件，计量资料以x珋± s表示。各指标采用单因素方差分析( ANOVA) ，双侧 t 检验。

结 果

1 比较几组大鼠给药前后的活动次数正常组、模型组、对照组、高中低 3 个剂量实验组

大 鼠 的 活 动 次 数 分 别 为 ( 47. 50 ±  15. 81 ) ，( 7. 50 ± 5. 24) ，( 34. 13  ± 21. 96 ) ，( 21. 88  ± 14. 47 ) ，( 16. 13 ± 10. 25 ) ，( 15. 25  ± 14. 02 )   次。与正常组比较，模型组差异有统计学差异( P ＜ 0. 01) ; 与模型组比较 对照组和高剂量实验组差异均有统计学差异( P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05 ) 。表明二甲双胍和氟西汀的联合用药以及高剂量左归降糖解郁方均可显著改善模型大鼠的抑郁样行为，增强其自主活动兴趣，见表 1。

2 比较几组大鼠给药前后的认知功能

正常组、模型组、对照组、高中低3 个剂量实验组大鼠的逃避潜伏期的直线回归方程如下: y = 66. 88 －10. 76x( Ｒ² = 0. 77) ，y = 63. 56 － 5. 964x( Ｒ² = 0. 35) ，y =68. 75 － 10. 25x ( Ｒ² = 0. 92) ，y = 67. 75 － 9. 51x ( Ｒ² =0. 80) ，y = 65. 19 － 6. 58x( Ｒ²  = 0. 59) ，y = 64. 69 － 5. 78x( Ｒ² = 0. 51) 。与正常组比较，模型组差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) 。与模型组比较，对照组和高剂量实验组差异均有统计学意义( 均 P ＜ 0. 05) ，见表 2。给药后第 5 天，正常组、模型组、对照组、高中低 3 个 剂 量 实 验 组 大 鼠 的 探 索 时 间 分 别 为( 36. 63 ± 13. 39) ，( 22. 25 ± 5. 42) ，( 31. 25  ± 10. 25 ) ，( 30. 75 ± 7. 92) ，( 28. 00 ± 10. 14) ，( 27. 63 ± 7. 09) s。与正常组比较，模型组差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) 。与模型组比较，对照组和高剂量实验组差异均有统计 学意义( 均 P ＜ 0. 05) ，见表 2。