·基础医学论著/ 研究·

冠通方对兔心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡形态学的影响

韦 斌1 ，王 强1 ，姜 浩2 ，朱志华1 ，陈广琴1 ，尹 玮1 ，骆 虹1

摘要: 目的        观察冠通方对兔心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的病理变化，进一步证实冠通方对心肌细胞的保护作用。方法 将 48 只新西兰大白兔随机分为假手术组、模型对照组、中药对照组、冠通方大剂量组、冠通方中剂量组、冠通方小剂量组，每组各 8 只。各组分别连续灌胃 14 d，制备左室心肌病理切片。比较各组病理切片在光镜下心肌细胞病理形态学结构变化，使用原位末端标记法( TUNEL 法) 测定各组凋亡细胞指数。结果 冠通方大、中剂量组心肌细胞在光镜下的结构形态得到较好的保护，冠通方大、中剂量组细胞凋亡指数较模型组显著下降( P ＜0．05) 。结论    冠通方可以减轻心肌缺血再灌注心肌细胞的损伤，有效减少心肌缺血再灌注后心肌细胞的凋亡，从而达到保护心肌细胞的作用。

关键词: 心肌缺血再灌注损伤; 冠通方; 机制研究

中图分类号: Ｒ542．2    Ｒ285．5    文献标识码: A    doi: 10．3969 / j．issn．1672-1349．2017．13．008    文章编号: 1672-1349( 2017) 13-1569-04

心肌缺血再灌注损伤( myocardial ischemia reperfu- sion injury，MIＲI) 是心脏缺血性病变再通后常见的并发症，可导致心肌细胞超微结构、功能、代谢及电生理  等方面发生进一步损伤，并可出现严重的心肌细胞内 凋亡基因的表达增高或心肌细胞凋亡。冠通方的近期 药理研究表明［1］:  使用冠通方预处理可使缺血再灌注损伤( IＲI) 大鼠模型的损伤心肌组织中白细胞介素-8 ( IL-8) 表达下降，白细胞介素-10( IL-10) 表达增高，有效抑制炎症机制及坏死机制，起保护心肌的作用。本 研究通过后期动物实验观察不同剂量的冠通方干预兔  心脏再灌注损伤后心肌细胞的凋亡及病理形态改变， 进一步验证了冠通方对心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物 48 只新西兰大白兔，购自广西医科大学实验动物中心［生产许可证号 SCXK( 桂) 2011-0003］，体质量 2．5 kg ～ 3 kg，适应性饲养 1 周后开始分组。

1.2 实验** 冠通方组成: 田七 45  g，生晒参 100 g，丹参 150 g，地龙 150 g，全瓜蒌 150 g，绞股蓝 150 g，麦冬 150  g，陈皮 100  g。由广西中医药大学制药厂按上述配方制成颗粒剂( 每包含生药 4 g) ，分装规格为每包 3．5 g。复方丹参滴丸( 每粒 27  mg) ，由天津天士力制药股份有限公司生产( 国药准字 Z10950111，生产批号 101210) 。

1.3 实验试剂及仪器 TUNEL 检测细胞凋亡试剂盒为德国 Ｒoche 公司生产，－20 ℃ 保存，使用前置于 4 ℃溶解混合; DAB 显色液试剂盒为北京中杉金桥生物有限公司生产，4 ℃ 保存，使用前置于室温与稀释液以 1

∶ 25 稀释混合，现配现用; 蛋白酶 K 溶液为北京中杉金桥生物有限公司生产，－20 ℃ 保存，使用前置于 4 ℃以 1 ∶ 25 稀释，现配现用; 磷酸盐缓冲液( PBS) 为北京中杉金桥生物有限公司生产，粉剂－ 4 ℃ 保存，使用前置于37 ℃ 与蒸馏水0 ． 01 mol / L 稀释，pH 为7 ． 2 ～ 7．4，现配现用; 其余甲醛、酒精、二甲苯等均为国药集团化学试剂有限公司生产，室温避光密封保存。全自动脱水机( 德国 Leica，ASP300S) ，石蜡切片机( 德国 Leica，ＲM2245) ，奥林巴斯显微镜( 日本  OLYMPUS， BX53) ，病理图文摄像头( 日本OLYMPUS，DP73) ，小动物呼吸机( 北京智鼠多宝生物科技有限公司，DW-3000) 。

1.4 方法

1.4.1 分组及给药 将 48 只新西兰大白兔按随机数字表法随机分为 6 组，分别为假手术组、模型对照组、中药对照组［复方丹参滴丸 54 mg / ( kg·d) ］、冠通方大剂量组［3．6 g / ( kg·d) ］、冠通方中剂量组［1．8 g / ( kg·

d) ］、冠通方小剂量组［0．9 g / ( kg·d) ］，每组 8 只。用药剂量根据人兔临床用药剂量换算公式［2］换算成兔用药量。实验动物行分笼饲养，于每天早上灌胃给药，假手术组和模型对照组予蒸馏水灌胃。各组均连续灌胃14 d，于末次给药 1 h 后进行标本采集。

1.4.2 2 模型建立 经耳缘静脉注射戊ba比妥钠 30 mg / kg 麻醉后，背位固定，四肢皮下连接心电图电极，记录标准  Ⅱ导联心电图。颈部正中切开皮肤，钝性分离颈前肌， 切开气管，插入 Y 型气管插管，连接微型人工 呼吸机( 潮气量1 0 mL / kg ～ 1 5 mL / kg ，频 率4 0次/ min) 。沿胸骨左缘 3 ～ 4 肋间隙开胸，暴露心脏。采用 5 ～ 0 线结扎冠状动脉左前降支(  LAD)  法制备心肌缺血再灌注模型，为避免实验动物心肌梗死面积过大导致死亡， 冠状动脉阻断点应在冠状动脉左前降支向下 5 mm ～ 10 mm 处选择结扎位点，以心电图出现 ST段弓背抬高和结扎线以下心肌组织颜色变暗、局部节段性运动不 良为结扎成功。待结扎 40 min 后剪断手术线实现再灌注，灌注时间为 2 h。以缺血区转红并反应性充血、收缩活动逐渐恢复、ST 段恢复 1 /2 以上为再灌注成功。假手术组只穿线不结扎，余操作同上。

1.4.3 标本采集及指标检测

IＲI 心肌组织 HE 染色病理切片 造模实验结束��，处死兔子，剪下心脏，造模实验结束后，处死兔子，剪下心脏，取左心室心肌( 包括缺血边缘区、心肌缺血区、冠状动脉结扎区心肌组织) 。将标本置于 10% 中性甲醛液中固定，经全自动脱水机脱水 14 h，常规石蜡包埋，石蜡切片厚 4 μm，常规脱蜡至水，进行 HE 染色、封片，镜下观察心肌组织基本病理改变。

1.4.3.1 TUNEL 法染色 参考罗氏 TUNEL 检测细胞凋亡试剂盒说明书进行，用 0．3%过氧化氢溶液封闭 30 min; 20 mg / L 蛋白酶 K 消化膜蛋白及核蛋白; 加入TUNEL 反应液，37  ℃ 孵育 60  min; 加入 FITC 标记抗体，DAB 显色，苏木素复染，脱水透明，封片。

1.4.3.2 心肌细胞凋亡指数测量   在光镜下观察心肌细胞凋亡情况，电镜下呈棕色颗粒者为染色阳性的凋亡心肌细胞。心肌细胞凋亡指数观察:  每只兔子观察4 张切片，每张切片在高倍镜下( 400 ×) 随机观察 5 个不同视野，每个视野计算凋亡细胞个数和所有细胞个数，以凋亡阳性细胞数/ 总细胞数的百分比为心肌细胞凋亡指数，取平均值。

1.5 统计学处理    本研究采用 SPSS Statistics 19．0 进行实验数据统计，用单因素方差分析，计量资料以均数 标准差( x ± s ) 表示，组间比较用q 检验，以P ＜

0．05 为差异有统计学意义。

2 结 果

各组心肌组织HE 染色病理形态比较 假手术组心肌细胞形态结构完整，细胞排列整齐，无明显病理损伤。MIＲI 模型组心肌细胞质增多，细胞肿胀明显，细胞排列紊乱、横纹不清，并呈现点片状坏死灶，提示细胞坏死程度严重。冠通方小剂量组可见心肌细胞水肿，排列紊乱，细胞浆增多，有明显的病理损伤。对照组和冠通方大、中剂量组心肌细胞肿胀较轻，心肌细胞偶有坏死，细胞排列有序。详见图 1。

各组心肌细胞凋亡情况比较 光镜下呈棕色的心肌细胞核为凋亡的阳性细胞，呈蓝色则为非凋亡的阴性细胞。本研究结果表明: 冠通方大、中剂量组凋亡细胞数较模型组显著减少。详见图 2。各组心肌细胞凋亡指数比较见表 1。

     3 讨 论

细胞凋亡是细胞死亡的一种形式，其参与缺血再 灌注损伤的病理过程，是缺血再灌注损伤引起心肌细 胞死亡的主要原因，成为缺血再灌注损伤影响组织心 脏功能的重要途径和表现形式。已有许多研究表明， MIＲI 与细胞凋亡密切相关［3-5］。因此，减少心肌细胞凋亡是减少缺血再灌注心肌损伤的有效途径。

MIＲI 中医病机包括气虚、血瘀、痰饮不同的病理过程。谢连娣等［6］指出，气虚导致血瘀和痰饮的形成， 血瘀和痰饮导致气虚程度进一步加重。急性心肌梗死 时血液供应骤然停止，失去了血液的濡养和运载; 急性心肌梗死时，血栓堵塞血液的正常运行，邪正交争，正 气损伤; 再灌注时突然过多的血液等待运送到组织远端，增加心脏的负担，均导致气虚的形成。心气虚无力 推动血液运行，造成微血管栓塞，形成“血瘀”。气虚血瘀可以导致水液代谢受到影响，水液留聚，形成“痰 饮”。多数学者亦认为缺血再灌注损伤的过程涉及气虚、血瘀、痰饮、痰瘀化热化毒; 以气虚为本，血瘀痰饮为标。

冠通方方中田七善于**化瘀，消肿止痛，其化瘀 血而不伤新血; 丹参性寒凉血，又善**化瘀，清瘀热， 消痈肿，除烦**;  地龙咸寒，善于**祛瘀通络，同时又能清热化痰;  瓜蒌甘寒微苦，善于清热化痰，**宽胸，消肿散结，同时又具有润肠通便，泻腑安脏之功;  生 晒参善于大补元气，同时又有生津之功; 绞股蓝甘苦性寒具有**养阴，消热**，清热祛痰之功;  麦冬甘苦微寒，清热养阴生津;  陈皮辛散温通，善于**燥湿化 痰。诸药合用则具有**养阴，清热**化痰，**活  血化瘀通络之功［7］。田七又名三七，主产于云南、广西 等地。现代基础研究表明:    三七中含有三七总皂苷( PNS) ，三七的主要成分是三七总皂苷，已经有报道关于 PNS 有良好的抗氧化作用［8］，并能抵抗自由基对心肌缺血再灌注后导致的心肌细胞损伤。此外，三七皂  苷可抑制脂质过氧化反应，减轻心肌细胞的受损情况， 增强抗氧化效果，并具有抑制血小板聚集，促进纤维蛋  白溶酶的活性，降低血液黏度，促进血栓溶解，改善血  液流动的作用。顾国嵘等［9］通过酶学、形态学、**组织化学等研究表明，PNS 缺血预处理 24 h 后能明显减少缺血-再灌注导致的心肌细胞坏死和凋亡，对缺血- 再灌注心肌起到延迟保护作用，证明三七**缺血性 心脏病的基础。PNS 能扩张冠脉，增加心肌营养血流量，改善心肌微循环，明显降低心肌耗氧量。同时 PNS 的抗脂质过氧化作用也是其保护缺血-再灌注心肌的  重要方面。丹参的抗氧化成分有丹参酮类、丹参素、丹  酚酸类化合物、原儿茶醛、咖啡酸及迷迭香酸，有研究指出［10-11］，丹参酮 Ⅱ A  可抑制细胞膜上的  NADH /NADPH 氧化酶的激活，提高超氧化物歧化酶( SOD) 的活性，**氧自由基并抑制脂质过氧化反应，发挥保护血管内皮细胞的作用。研究表明［12］ 丹参冻干粉对经皮冠状动脉介入**( PCI) 后 MIＲI 有保护作用，其可能的机制是抑制炎症反应，改善内皮功能。

本研究通过冠通方对兔 MIＲI 心肌细胞凋亡研究时发现，冠通方可有效发挥心肌细胞保护作用，使 MI- ＲI 细胞凋亡趋势下降、减少心肌病理损伤，为心肌细胞后期修复打好了坚实的基础。冠通方对 MIＲI 损伤心肌的保护作用是多机制、多靶点、综合作用，因此冠通方对心肌细胞的保护机制依然需要后续探索研究。