益智乙醇提取物**抗氧化及改善小鼠认知状况活性研究
赵嘉宝1，苏 航1，齐 钰1，肖 锋2，毕开顺3，贾 英2*
( 1． 沈阳药科大学中药学院，沈阳市中药药效物质基础筛选与评价重点实验室，辽宁 沈阳 110016; 2． 沈阳药科大学功能食品与葡萄酒学院，沈阳市中药药效物质基础筛选与评价重点实验室，辽宁 沈阳 110016; 3． 沈阳药科大学药学院，中药质量控制关键技术国家地方联合工程实验室，辽宁 沈阳 110016)
摘要: 目的 考察益智醇提取物体外**抗氧化活性以及改善小鼠认知状况的能力。方法 以益智醇提取物为实验对象， 采用小鼠足肿胀、腹腔注射醋酸致****通透性改变等实验，并检测小鼠致炎部位前列腺素 E2 含量和肝匀浆中丙二 醛含量，来评估益智醇提取物的**抗氧化活性。采用 Morris 水迷宫法，检测益智提取物对于阿尔兹海默病( AD) 模型 小鼠认知状况改善能力。结果 益智醇提取物在小鼠足肿胀实验及醋酸致小鼠腹腔****通透性改变实验中表现出和阿司匹林接近的**活性，其对小鼠后足肿胀抑制率达到 61． 60% ，炎症组织中致炎因子含量对比于对照组表现出显著抑制情况( P ＜ 0． 01) 。益智醇提取物在小鼠脂质过氧化反应实验中也表现出较好的抗氧化活性，抑制率达到 32． 50% ， 效果接近维生素 C。水迷宫实验结果显示益智提取物能够改善 AD 模型小鼠认知状况，且效果和多奈哌齐效果接近。结 论 益智提取物表现出良好的**抗氧化以及改善小鼠认知状况活性。
关键词: 益智; 提取物; **; 抗氧化; 认知状况
DOI 标识: doi: 10． 3969 /j． issn． 1008-0805． 2017． 05． 013
中图分类号: Ｒ285． 5 文献标识码: A 文章编号: 1008-0805( 2017) 05-1057-03
炎症反应是机体内部基本病理反应过程，其发**展伴随着 一系列炎症因子的复杂变化，过度激活会影响机体正常代谢过 程。氧化应激是指机体氧化还原水平失衡，产生过多的氧化产物，导致机体抗氧化能力下降，*终导致组织损伤［1］，引起一系列**的发生，例如: 阿尔兹海默病［2，3］、糖尿病［4］ 等。炎症反应和氧化应激是很多**的发病原因或促进因素，**如果具有抗 炎或抗氧化活性，则能够在一定程度上****，例如**** 及具有**活性或抗氧化活性的提取物对于阿尔兹海默病的治疗［5 ～ 7］。益智为姜科植物益智 Alpinia oxyphylla Miq． 的干燥成熟果实，有暖肾固精缩尿、温脾止泻摄唾的功效［8］，是卫生部认定的药食同源的物品之一。本文对益智提取物的**抗氧化以及 改善 AD 模型小鼠认知状况活性做了深入研究。以小鼠足肿胀实验和腹腔注射醋酸致血管渗透性增高实验以及致炎部位前列 腺素 E2 的含量测定来评估**的**效果，以肝组织自氧化程度测定来评估**的体外抗氧化效果，我们的实验结果表明益智 提取物表现出良好的**抗氧化活性。同时，水迷宫实验结果表 明益智提取物能够改善 AD 模型小鼠认知状况，但是其产生此效果的原因尚不明确，需要进行更深入研究探索。
1 材料与仪器
1． 1 动物 昆明小鼠，雄性，体重 25g，购自沈阳药科大学动物管理中心，适应环境 3 天后开始实验。合格证号: SSYPU － IACUC － C2016 － 0506 － 103。
1． 2 材料和仪器 材料: 益智仁购自沈阳市同仁堂药房，经沈阳药科大学生药学教研室贾英教授鉴定，均为**，密封存放于阴凉干燥处。伊文思蓝( 购自 Sigma 公司，批号 314 － 13 － 6) ，硫代***酸( 购自大连美仑生物技术有限公司，批号 504 － 17 － 6) ， 二甲基亚砜、生理盐水、三***、氢氧化钾、甲醇、95% 乙醇、冰醋酸( 购自山东禹王化学试剂有限公司) ，阿司匹林肠溶片( 购自国大药房) ，多奈哌齐( 购自大连美仑生物技术有限公司) 。
1. 3 仪器 HH － 4 型数显电热恒温水浴锅( 国华电器有限公司) ; ＲE － 52A 型旋转蒸发仪( 上海亚荣生化仪器厂) ; Varioskan Flash 酶标仪( 赛默飞世尔科技公司) ; Morris 水迷宫( 北京智鼠多宝有限公司) 。
2 方法
2. 1 益智提取物的制备 益智粉碎，过 60 目筛，称取益智粉末500 g，加入两倍体积 95% 乙醇，加热回流 3 次，每次 3 h，合并滤液蒸干后得益智醇提取物 89． 2 g。
2． 2 小鼠足肿胀实验 小鼠随机分为 4 组，每组 6 只，分别为: ( 1) 对照组，灌胃给予 CMC － Na; ( 2) 阳**组，灌胃给予阿司匹林肠溶片溶液; ( 3 ) 益智提取物低剂量给药组，剂量 30 mg · kg － 1 ，灌胃给药; ( 4) 益智提取物高剂量给药组，剂量 60 mg ·
kg － 1 ，灌胃给药。小鼠连续给药 5d，给药剂量 0． 1 ml·10 g － 1 。末次给药后 1 h，在小鼠后两足足踝处同一位置各作一标记，在右后足足垫部注射新鲜配置的鸡蛋清溶液 0． 05 ml，于注射 1 h 后剪下后两足，称重，计算肿胀度和肿胀抑制率。
2． 3 炎症组织中前列腺素 E2 ( PGE2 ) 含量测定 将剪下的致炎足浸于 5 ml 生理盐水中，剪碎，浸泡 2 h 后，3000 r·min － 1 离心 10 min。取上清液 0． 2 ml，加入 0． 5 mol·L － 1 KOH·甲醇溶液 2 ml，在 50℃ 水浴异构化 20 min 后，用甲醇定容到 4 ml，在 278 nm波长下测吸光度值，以此值代表 PGE2 的含量。
2． 4 醋酸所致小鼠****通透��增高实验小鼠随机分为 4组，每组 6 只，分组和给**式同“2． 2”。末次给药 1 h 后，小鼠尾静脉注射 0． 5% 伊文思蓝生理盐水溶液 0． 1 ml·10 g － 1 ，随后腹腔注射 0． 6% 醋酸溶液 0． 1 ml·10 g － 1 ，20 min 后处死小鼠，腹腔注射 6 ml 生理盐水，轻揉小鼠腹部，剪开小鼠腹部皮毛，暴露腹腔，收集腹腔液，3000 r·min － 1 ，离心 10 min，590 nm 测吸光度值，比较各组吸光度值，观察小鼠****通透性的改变状况。
2． 5 小鼠肝组织匀浆内丙二醛( MDA) 含量测定 取小鼠处死后迅速分离肝组织，用冷生理盐水洗净，冰浴匀浆，制成肝匀浆。取4 支试管，每支加入肝匀浆 0． 5 ml，分别加入 3% 过氧化氢溶液0． 2 ml，再分别加入 1 ml 样品( DMSO，Vc 溶液 1 mg·ml － 1 ，益智mg·ml － 1 ，益智 6 mg·ml － 1 ，样品皆溶于 DMSO 中配置) ，37 ℃温浴 1 h，加入 20% 三***溶液 1 ml，0． 67% 硫代***酸溶液 1 ml，沸水浴 15 min，冷却后，4000 r· min － 1 离心 10 min，532nm 波长处测吸光度值，此值作为肝匀浆中 MDA 的含量，并计算抑制率，每个样品做 2 个平行样。
2． 6 益智醇提取物对于改善小鼠认知状况活性测试 小鼠随机分为 6 组，每组 6 只，分别为: ( 1) 空白组，灌胃给予 CMC － Na; ( 2) 对照组，小鼠脑室注射 Aβ 3 μl 后恢复三天，灌胃给予 CMC － Na; ( 3) 阳**组，小鼠脑室注射 Aβ 3 μl 后恢复 3 天，灌胃给予多奈哌齐溶液 3 mg·kg － 1 ; ( 4) 益智提取物低剂量给药组，小鼠脑室注射 Aβ 3 μl 后恢复 3 天，灌胃给药剂量 30 mg·kg － 1 ; ( 5)
益智提取物高剂量给药组，小鼠脑室注射 Aβ 3 μl 后恢复 3 天， 灌胃给药剂量 60 mg·kg － 1 ; ( 6) 空白给药组，灌胃给予益智提取物 60 mg·kg － 1 。脑室注射定位: AP，－ 0． 5mm; ML，－ 1． 1mm; DV，－ 3． 0mm。小鼠连续给药 30 天，给药剂量 0． 1 ml·10 g － 1 。给药结束后，小鼠进行为期 6 天的 Morris 水迷宫实验，操作方法参考文献［9］。
2. 7 统计学方法 采用 SPSS 16． 0 统计软件对实验结果进行分析，正态计量数据用“x珋± s”表示，多组间比较采用单因素方差分析，以 P ＜ 0． 05 为显著差异节点。
3 结果
1 小鼠足肿胀结果 各组小鼠左足在实验结束后重量无显著差异，可以排除小鼠个体差异性对鼠足重量的影响。小鼠右足经 过鸡蛋清注射处理 1 h 后，对比于对照组，给药组表现出显著的肿胀情况，其中阿司匹林组( P ＜ 0． 05，抑制率 80． 70% ) 、低剂量给药组( P ＜ 0． 05，抑制率 79． 40% ) 表现出显著的肿胀抑制。此结果表明，益智醇提取物能够抑制鸡蛋清导致的小鼠肿胀情况， 且低剂量表现出更好的效果，肿胀抑制率数据也支持这一结论。 小鼠致炎后致炎部位肿胀度及肿胀抑制率结果见表 1。
3． 2 小鼠致炎部位 PGE2 含量测定结果 由实验结果可知，对比与对照组，阿司匹林组、低剂量组、高剂量组都表现出显著的致炎部位 PGE2 含量降低的现象( P ＜ 0． 01) ，PGE2 作为体内一种典型的炎症指标，它的含量降低表明给药降低了组织炎症。三个给药 组对比发现，低剂量组和阿司匹林组效果更接近，表现出更好的 **活性。小鼠致炎部位 PGE2 含量测定结果见图 1。
3． 3 醋酸所致小鼠****通透性增高实验结果 此实验结果和“3． 2”实验结果一致，三个给药组表现出显著的降低小鼠****通透性的状况( P ＜ 0． 01) ，其中低剂量组效果和阳**组效果*接近，**效果更优。醋酸所致小鼠****通透性增高实 验结果见图 2。
3． 4 小鼠肝组织匀浆内 MDA 含量测定结果 MDA 是脂质过氧化反应的终产物，其含量代表体内脂质过氧化反应程度。由实验 结果可知，对比于对照组，三个给药组都表现出显著的肝匀浆内MDA 含量降低的现象，其中低剂量组的降低效果与 Vc 组更接近，抗氧化活性更显著。小鼠肝组织匀浆内 MDA 含量测定结果见表 2。
3． 5 益智提取物对于改善小鼠认知状况活性研究 水迷宫的逃避潜伏期能够反映动物短期记忆能力，时间越短代表动物记忆认知能力越好。由实验结果可知，**天和**天各组小鼠逃避潜伏期未表现出显著差异，第三天开始，相比于模型组，空白组和给药组陆续表现出逃避潜伏期时间显著缩短，表明**能够改善小鼠认知状况和记忆能力，且益智高剂量组效果优于低剂量组，和多奈哌齐给药组更为接近。另外，空白给药组的实验结果显示， 益智提取物对于正常小鼠无抑制作用，一定程度上表明益智提取物对于动物不产生毒性作用。益智提取物对于改善小鼠认知状况活性研究结果见表 3。
4 讨论
益智作为中药材，其化学成分和药理作用已得到多方考察和 研究。除药典记录的功效外，益智已被证实还具有**［10］、抗过 敏［11］、抗氧化［12］、改善学习记忆能力［13］、保护胃肠道系统［14］、神 经保护［15］、镇痛［16］等功效，而益智醇提取物中所含化学成分，例 如: 益智酮甲、益智醇、诺卡酮［17］、白杨素、杨芽黄素［18］、山萘酚
－ 4＇－ 0 － 甲醚［19］等，和这些药理活性紧密联系。
本实验选用益智作为原材料，经过提取得到其醇提取物，并 对其**抗氧化活性进行了研究，结果显示其对于小鼠足肿胀和 醋酸所致****通透性升高有显著的抑制作用，对肝匀浆内MDA 含量测定结果也表现出其具有显著的抗氧化活性。在我们的实验中，益智低剂量 30 mg·kg － 1 比高剂量 60 mg·kg － 1 表现出更好的**抗氧化活性。基于**的抗氧化能力和其对抗 AD 的能力息息相关，我们随后进行了 AD 模型小鼠的认知状况和记忆能力考察实验，实验结果表明益智提取物表现出良好的改善认 知状况的能力，但是高剂量组 60 mg·kg － 1 比低剂量 30 mg·kg － 1 效果更好，这与体外抗氧化**实验结果不一致，表明体外实验 结果不能完全套用到体内实验中，两者应结合考察。因此在今后 的研究中，我们会继续使用益智提取物进行给药，以其进入体内 转化形式和代谢途径为主要研究方向进行深入探索，研究其改善 认知状况的根本原因。