改良型**性股骨头坏死小鼠模型的建立与评价*
王继涛 1，3 阮红峰 1，2 付方达 1，3 吴承亮 1，2△
（1.浙江中医药大学**临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学骨伤研究所，浙江 杭州 310053；3.浙江省中医院，浙江 杭州 310006）
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1004-745X（2017）09-1525-04 doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.007
【摘要】 目的 为建立有效的动物模型，更好研究**性股骨头坏死的发病机制，科学阐明中**剂**该**的分子作用机制。 方法 取 45 只 2 月龄雄性 C57BL/6 小鼠随机平均分为对照组、传统组、改良组。 传统组给予脂多糖联合甲强龙**造模， 改良组小鼠则在传统组基础上调整饲料槽的高度， 迫使小鼠主动站立取食，并予跑步机上跑步 2 h/d；对照组给予等量的生理盐水。 定时观察小鼠一般状况，分别于造模前、造模后第4 周、第 8 周抽血检测血液中三酰甘油的含量，并于造模后 8 周测量小鼠股骨头骨密度，次日处死取双侧股骨头，体视显微镜下观察股骨头外观及色泽。 采用苏木精-伊红染色法（HE）及阿尔新蓝染色（ABH）等技术观察小鼠股骨头病理变化。 结果 传统组和改良组小鼠精神状态明显差于对照组， 且改良组差于传统组 （P < 0.05）；传统组和改良组血液中三酰甘油的含量高于对照组，改良组高于传统组；骨密度检测显示，传统组和 改良组骨密度低于对照组，且改良组低于传统组（P < 0.05）；股骨头形态学观察发现改良组股骨头软骨下出血坏死的面积较传统组严重，HE、ABH 结果显示，传统组有 9 只出现（空骨陷窝数量增多，骨小梁变细甚至断裂）等骨坏死表现，造模成功率达 60%，改良组有 11 只出现（空骨陷窝数量增多，骨小梁变细甚至断裂）股骨头坏死的表现，造模成功率高达 73.3%（P < 0.05）。结论 传统造模方法和改良造模方法皆可造模成功，但改良造模方法具有更高成模率。
【关键词】 **性股骨头坏死 动物模型 甲强龙 脂多糖 跑步机
股骨头坏死（ONFH）是骨科临床难题之一。 据流行病学报道， 在中国每年新增 50~75000 例股骨头坏死患者［1］。 其中**性股骨头坏死（SONFH）发病率占非创伤性股骨头坏死的一半以上［2］。 SONFH 发病好发于青壮年，具有双侧高发病率的特点，且发病率逐年上升［3-4］；若不能进行及时有效地**，70%的患者*终将发生股骨头塌陷， 给个人和社会带来沉重的心理和经济负担［5］。 当前 SONFH 确切的发病机制和始动因素仍不明确， 因此建立一个全过程高度模拟人类早期SONFH 的动物模型显得尤为迫切和重要。 本研究参照RyooS 等［6］的方法并加以改进，小剂量脂多糖联合大剂量甲强龙诱导 C57BL/6 小鼠早期股骨头缺血性坏死， 为研究早期 SONFH 的**和预防研究提供动物模型。 现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物 2 月龄 SPF 级雄性 C57 小鼠 45 只， 由浙江中医药大学实验动物中心提供， 动物许可证号：ACXK（沪）2015-0016。 实验动物随机平均分为 3组：传统组（**加内**组）、改良组（在传统组的基础上进行站立取食联合运动）以及对照组（仅予等量生理盐水）。
1.2 试剂与仪器 大肠杆菌内** （Sigma 公司，美国批号 L2880， 规格 10 mg）； 甲泼尼龙琥珀酸钠（ 甲强龙）（Pfizer Manufacturing Belgium NV 公司， 批号： A07056）；光学显微镜（Olympus 公司，日本），Milli-QS超纯水器（美国 Millipore 公司），青霉素钠（华北制药股份有限公司， 批号：F3117217）；Sartorius BS110S 万分之一电子天平（德国塞多利斯公司）；INSTRON 万能材料试验机（美国英斯特朗公司），小鼠跑步机（北京智鼠多宝公司），RM2235 石蜡切片机、LEICADM500 三目生物显微镜及图像信号采集与分析系统（德国 Leica 公司）。
1.3 模型制备 传统组小鼠腹腔注射脂多糖 20 μg/kg，每日 1 次，连续注射 2 d；第 3 天开始臀肌注射 100 mg/kg 的甲强龙，连续注射 2 周；第 3 周开始隔天注射** 1 次直至取材。 改良组在传统组基础上调整饲料高度迫使小鼠站立取食增加运动，并予跑步机跑步 2 h/d。 对照组不做任何处理， 并腹腔注射等量的生理盐水。 所有动物每周臀部注射 3 万 U 青霉素预防感染。 造模 8 周后取材（双侧股骨头）。
1.4 检测指标
1.4.1 动物一般体征 注射**后连续 8 周， 每日观察各组动物注射后饮食、排便次数、皮毛光泽、体质量、精神状态等情况。
1.4.2 小鼠血液学检查 分别于造模前、 造模后第 4 周、第 8 周检测血液中三酰甘油（TG）的含量。 取血方法：戳刺小鼠眼睑，放血 1 滴，吸取血滴，置于 500 μL 的 EP 管中。
1.4.3 Micro-CT 检测及骨密度分析 造模后 8 周，各组小鼠分批麻醉放在 Micro-CT 上扫描，对小鼠双侧股骨进行扫描。 通过相应分析软件， 测得小鼠各组股骨头骨密度。
1.4.4 形态学观察 在无菌条件下， 用 0.02%的*钠对小鼠（0.2 mL/10 g）进行腹腔注射，麻醉后将小鼠仰卧位固定于手术台上， 逐层分离直至暴露髋关节，取出股骨头。 用 1×PBS 清洗股骨头，予体视显微镜下观察双侧股骨头外观及色泽。
1.4.5 组织病理检查 组织置于 4%多聚甲醛固定 3 d， 流水冲洗过夜，脱钙 10 d 后，以针头无阻力刺透为度。随后进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、进行 HE、ABH 染色，光镜下观察股骨头外形、软骨、���小梁、软骨细胞的变化。
1.5 统计学处理 应用 SPSS12.0 统计软件。 计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析。 P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1动物一般体征观察 造模后， 定时观察和比较 3 组小鼠的行为学差异，包括饮食、排便次数、皮毛光泽、体质量、精神状态等。 脂多糖腹腔注射后，传统组和改良组均出现不同程度的精神萎靡。注射**第 3 天后， 除对照组外，传统组和改良组均出现大便稀溏，饮食和活动均减少的表现。 第 10 天后开始上述症状开始减轻，造模期间均未出现溃疡，脱毛现象，改良组小鼠精神状态较传统组差。对照组与传统组和改良组比较，对照组小鼠精神状态正常，活动自如，饮食正常，皮毛光泽。 各组小鼠体质量变化见表 1。 由表可知，**具有能够减轻小鼠体质量的作用，造模后 4、8 周，传统组和改良组小鼠体质量较对照组明显减轻（P ＜ 0.05），改良组与传统组体质量差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.2 各组小鼠各时间点 TG 比较 见表 2。 TG 水平在造模前、造模后第 4 周、8 周呈渐增趋势， 第 4 周传统组和改良组与对照组相比差异均有统计学意义（P ＜ 0.05），传统组和改良组差异无统计学意义（P > 0.05）； 第 8 周时，传统组和改良组差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）。
2.3各组小鼠各时间点股骨头骨密度比较 见表 3。Micro-CT 显示，**注射后股骨头密度逐渐减少。 取材时发现改良组较传统组、 对照组两组更容易发生骨折，传统组和改良组差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）。
2.4 各组小鼠股骨头形态学观察 见图 1。 造模 8 周后，对照组股骨头外观明亮洁白，关节表面光滑；传统组大部分小鼠股骨头表面有小面积软骨下出血坏死； 改良组大部分小鼠股骨头软骨下坏死的程度和范围严 重，软骨关节表面粗糙，出现囊性样改变。
2.5 各组小鼠股骨头组织病理学检察 图 2 为 HE 染色，背景为粉红色，细胞核为蓝紫色。 对照组小鼠股骨头形态正常，骨小梁排列紧密，排列整齐。 传统组 8周模型小鼠股骨头外形圆滑，骨小梁排列紊乱，改良组8 周模型小鼠股骨头，骨小梁排列不规则，骨髓腔细胞死亡、脱落。 图 3 为 ABH 染色，背景为红色，软骨为蓝色。 对照组小鼠股骨头形态正常，软骨表面光滑，软骨基质含量较多，染色较深。传统组小鼠股骨头骺软骨区厚度变薄，软骨成分含量减少，染色变浅，骨小梁变细， 部分出现断裂。 改良组小鼠股骨骺软骨区厚度显著变薄，骨小梁变细，部分断裂甚至坏死，先前完整的骨骺线开始变得模糊，伴有纤维结构增生，甚至有骨桥形成。
3 讨 论
临床上， 许多**的**都需要长期服用大剂量**类**，例如肾病综合征，支气管**，SARS 等， 其带来的并发症股骨头坏死也是很常见的。 SONFH 的患病人数也越来越多，但其发病机制尚不清楚，且缺乏切实有效的早期诊断和预防方法。 因此建立与人类SONFH 临床病理特征相似的动物模型并探索其发病机制，寻求有效的**和预防方法就显得尤为重要［7］。
SONFH 患者存在共同的病理特征，即在应用**前就已经有过敏性血管炎［8］。 内**使血管内皮发生损伤， 造成血液的流速减慢，血管内易凝血的状态，在此基础上大剂量应用**更符合临床发病特征， 且有更好的成模率［9-10］。 因此，模型建立选择**联合内**。
理想的 SONFH 的动物模型应具有和人类高度相似的生理、病理、解剖特点， 能够有效地模拟 SONFH 发展过程。 当前主要用兔和鼠用于 SONFH 造模。 选用小鼠作为实验动物。小鼠是四肢动物，具有体质量轻的特点，虽然难以造成股骨头塌陷的模型，但是小鼠作为实验动物有着自身独特的优势。首先，小鼠的造模时间比较短，其次小鼠的活动空间大便于饲养，调整饲料槽的位置，使小鼠主动站立取食，模拟人股骨头的受力状态，有利于观察**的发展过程。 更重要的是，小鼠与人体的基因具有高度的同源性，这种基因的同源性，使得小鼠生理生化与发育过程的指标与人体大致相似［11］， 从而对环境及**的反应也基本相同。 为此， 选用小鼠作为实验动物。 常用的造模方法有：单纯**、脂多糖联合**、异体血清联合**等方法［12-14］。 本课题组经过前期的预实验，发现**用量在 20~100 mg/kg 的范围内都属于**用量，相关研究证实在**范围内， **用量越大骨坏死发生率越高。 故采用的是脂多糖（20 mg/kg）联合大剂量的**（100 mg/kg）同时配合站立取食联合运动方法。 本模型具有两方面优势， 一方面迫使小鼠站立取食，能够模拟人股骨头受力［15］。另一方面，运动可以模拟人 SONFH 早期的日常生活状态。造模 8 周，B 组 15 只小鼠中出现 9 只股骨头坏死的表现，成模率达 60%；而 C 组 15 只小鼠出现 10 只股骨头坏死的表现；成模率高达 73.3%，由此可见改良方法优于传统造模方法。 造模过程中未出现小鼠死亡，这可能与无菌的操作习惯和良好的饲养环境有关。
本模型模拟 SONFH 的早期病变，具有以下优点： 1）模型诱导时间比较短，SONFH 效果明确；2）实验动物存活率高，具有较好的成模率；3）与临床上**性股骨头坏死的发病十分相似；4）**联合运动方法，能较好地模拟人发病早期的日常生活状态。该模型建立，为早期**性股骨头缺血性坏死研究提供了可靠的实验 模型。
综上所述， 脂多糖联合甲强龙加站立喂食联合运动方法能够诱导小鼠早期**性股骨头缺血性坏死的 发生，同时具有方法简单、操作方便，成本低廉，成功率高的特点，有效地模拟 SONFH 早期的发病过程，所以该方法值得在股骨头坏死的动物实验中推广应用。