RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
试验前注意：
1. 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
试验过程：
实验器具：
1、 移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、 吸头：1ml、200μl、20μl
3、 匀浆管：5ml
4、 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个
5、 EP管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、 试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶(广口，带盖)1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇
7、 量筒：50ml、250ml、500ml
8、 容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、 试管架：5ml、1.5ml、20μl
10、 盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水
11、 铝制饭盒：4个
12、 塑料小饭盒：1个
13、 大瓷缸：2个
14、 锡泊纸：一卷
15、 卷纸：2卷
16、 三角烧瓶：带盖，稍大
实验器具的处理与准备：
1、 塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次(EP管)。
2、 玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干)。
3、 匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，再高压(不需要泡DEPC
试验试剂：
1、 DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、 75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)。
3、 异丙醇：放入棕色瓶中。
4、 氯仿：放入棕色瓶中。
5、 琼脂糖
几种缓冲液的配制：
1、 电泳缓冲液： Tris? ?54g??硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml pH8.0 蒸溜水 1000ml。
2、 5×TBE (贮存液)再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度)，如取50ml贮存液加入450ml水——→500ml工作缓冲液。
3、 上样缓冲液：0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6×缓冲液，4℃保存
琼脂糖凝胶的配制：
1、 1.0%： 1.0g琼脂糖加入100ml电泳缓冲液中，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后进行电泳。
2、 1.5%:同上，将琼脂糖的量改为1.5g。
Rt-PCR材料：
Taq酶(含MgCl2 Buffer)
dNTP
oligo(dT)15
promega M-MLV
promega (Buffer)
RNasin
DEPC
Trizol
Invitrogen Life technologies
Marker
引物合成
1、 内参照：
正义：5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′
反义：5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′
β-actin
正义：5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′
反义：5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′
2、 par-4:
正义：5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′
反义：5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′
3、 退火温度计算
2(A+T)+4(G+C)
正反义平均数，再上下波动度(±4℃，或±5℃)
4、 引物各合成5 OD，每OD一瓶分装好
5、 引物稀释：
加DEPC水量为(μl)= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100 稀释为10p mol / μl 浓度的引物溶液
试验步骤：
1. RNA提取(略参见RNA实验技术版块)
2. cDNA的合成：
逆转录体系的组成：
50ul PCR体系：
10×PCRbuffer 5ul
MgCl2 3ul(2.0mM)
10mMdNTPs 1ul
sense primer 1ul(1umol/l)
antisense primer 1ul(1umol/l)
cDNA 1.5ul
DEPC处理水 36.7ul
Taq 酶 0.8ul
总体积 50ul
3. PCR反应条件：
94 ℃ 5min
94 ℃ 1min
退火温度 40sec
72 ℃ 50sec
72 ℃ 7min
4 ℃ 0sec
29 cycles
取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳
4. 电泳：约1.25小时
先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察。
注意事项：
1、 逆转录的关键步骤是立即冰水浴。
2、 Rt时，先打开PCR预热30分钟。
3、 RNA抽提前，打开离心机预冷。
4、 在所有RNA实验中，关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要较大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压**等。
5、 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
6、 RT按要求做，一般不会出太大问题。
7、 PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
8、 注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人：氯仿、溴化乙锭(EB)、酚、异硫氰酸胍、紫外线等
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