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肿瘤动物模型的构建

**类是皮下移植瘤动物模型

顾名思义,这种模型的建立是将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植在小鼠的皮下。种植的点也有讲究,一般选择血运**回流丰富的腹股沟和腋窝。可根据实验设计选择移植点,统一移植点的位置,除了遵守实验统一的条件外,待肿瘤成熟后收集肿瘤时留下照片证据也显得美观。

裸鼠(Balb/c 鼠, 无毛发, T **细胞缺陷)是比较常见和常用的实验用鼠,尤其是在皮下移植瘤肿瘤模型的建立中起到重要作用。裸鼠移植瘤模型的建立具有建立周期短、成瘤率高、易于操作、成本低的优点。当然,这种肿瘤模型也有缺陷,即不能很准确的模拟正常人体肿瘤发**展的过程。

肿瘤细胞移植时的简要步骤

首先准备好要移植的肿瘤细胞(细胞量根据不同肿瘤略有不同,我们所用的前列腺癌细胞系每个移植点一般选择 1x106 左右;肿瘤细胞可与基质胶 1:1 混匀后用 1 ml 注射器吸取,基质胶能够给肿瘤细胞提供营养环境,有助于肿瘤细胞生长)。

戴无菌手套后,将小鼠用左手大拇指和食指捏住颈部皮肤,然后将鼠尾用左手无名指和小指固定于左手大鱼际。将腋窝或腹股沟用 75% 酒精** 3 次。右手持吸有肿瘤细胞和基质胶混合液的注射器,在腹股沟或腋窝的位置,45 度斜角进针,注意不要突破腹膜,将针头保持于皮下位置。

然后近水平位置将针头几乎完全插入皮下,将混有基质胶的肿瘤细胞注射入皮下(肿瘤细胞量约 1x106),快速退针,左手食指轻压针孔约 1 min 后将小鼠放回饲养笼中,注意将小鼠侧放于垫料上,放置其不适呕吐时呕吐物误入呼吸道引起窒息。2~3 h 后观察小鼠是否苏醒。

如果是利用肿瘤组织(人体肿瘤标本或小鼠移植瘤传代)建立裸鼠皮下移植瘤模型,则需要首先将肿瘤组织用无菌 PBS(或 1640 培养基)洗涤 3 次,然后在无菌平皿上切成或用无菌剪刀剪成<1 mm3 体积的小块(种植前可裹基质胶)备用。

将小鼠用水合氯醛麻醉后平卧于解剖板上,四肢用胶带固定,将腋窝或腹股沟用 75% 酒精** 3 次,然后用眼科剪剪开约 0.5 cm 小口,小镊子将皮下筋膜与皮肤分开,然后将肿瘤组织放入贴近腹股沟或腋窝的深部,每个位置放置 2~3 块肿瘤组织,注意不同组间统一放置肿瘤组织块数以保持一致。

然后缝合皮肤,**后将小鼠侧卧位放置于饲养笼的垫料上。2~3 h 后观察小鼠是否苏醒。


影响皮下移植瘤肿瘤形成因素

1. 移植肿瘤细胞的生长状态:肿瘤细胞应选取传代后汇合度达 60%~80% 为理想状态,此时细胞生长进入对数期,生长速度快,状态理想,易于形成移植瘤。

2. 肿瘤细胞收集后种植到小鼠皮下不宜时间过长,应尽快种植到小鼠体内,我们一般在 2 h 内完成。

3. 裹有基质胶的肿瘤细胞种植比单纯的肿瘤细胞种植更易成瘤。基质胶为肿瘤细胞在接受宿主营养之前提供充足营养环境,起到桥梁的作用。

4. 肿瘤组织移植种植时,应将肿瘤组织切成 1 mm3 的小块,过小或过大均不利于肿瘤形成,组织块过大时不利于肿瘤组织中的肿瘤细胞接触新的环境生长,组织块过小时则肿瘤细胞过少,大部分在切块时破坏,均不利于肿瘤形成。

另外从肿瘤组织离体到种植到小鼠皮下不宜时间过长,我们一般在 4 h 内完成移植种植。


02**类是肾被膜下移植瘤动物模型

肾被膜下血运较为丰富,比较适合那些对肿瘤营养环境要求苛刻的肿瘤细胞。

用于肾被膜下移植瘤的小鼠主要是 NOD-D 鼠(D 鼠与非肥胖糖尿病鼠(nonobese diabetic,NOD)杂交而来,T 和 B **细胞、抗原呈递细胞、循环组分及部分 NK 细胞缺陷),这种小鼠表型为白色毛发小鼠,对于饲养条件较为苛刻,需要无菌的 SPF 级饲养环境。

不易成瘤的肿瘤组织一般选择肿瘤肾被膜下种植移植瘤模型。建立模型时,同样首先需要将肿瘤组织用无菌 PBS(或 1640 培养基)洗涤 3 次,然后在无菌平皿上切成或用无菌剪刀剪成<1 mm3 体积的小块(种植前可裹基质胶)。

将小鼠用水合氯醛麻醉后俯卧于解剖板上,四肢用胶带固定,在肋脊角靠下的位置剪去约 1.5 cm 直径的皮肤毛发以备皮。75% 酒精** 3 次,用眼科剪将皮肤剪开约 0.5 cm 小口,依次分离皮肤、皮下、侧腹膜。

找到肾脏位置,小心仔细将肾脏提至皮肤切口出,用小尖镊子戳开肾被膜一小口,仔细将小块肿瘤组织送入肾被膜下,一般 2~3 块。然后将肾脏送回腹腔,依次缝合腹膜、皮下组织和皮肤。**后将小鼠放回饲养笼内。2~3 h 后观察是否苏醒。


影响肾被膜下移植瘤肿瘤动物模型形成因素

1. 肿瘤组织处理是否恰当,除和皮下移植瘤相同处理外,应注意多裹些基质胶在肿瘤组织小块上,在塞进肾被膜下时应尽量注意尽量保持肾被膜完整。我们曾单纯将肿瘤组织种植到肾被膜下,成瘤率较低,而裹有基质胶的肿瘤组织较易成瘤。

2. 注意手术时及时找到出血点并及时止血,侧腹膜解剖时损伤,误伤肾脏、肾脏血管等,如不及时处理,很容易引起出血过多导致失血性休克。尤其是阴性出血不易察觉,在**天查看小鼠情况时发现小鼠已死亡等。

3. 手术器械需****,操作台需要无菌环境,避免因感染引起术后小鼠死亡。


03第三类是原位移植瘤动物模型

为了更好的模拟肿瘤的生长情况选择发生肿瘤的器官为移植点。常用的小鼠仍为 NOD-D 鼠。采取开放手术打开暴露相应的发生肿瘤的对应的小鼠器官,将肿瘤组织或肿瘤细胞种植到器官内。此方式因不易操作,且小鼠手术后死亡率较高,一般不常选用。

小鼠实验分组一般 5 只以上为一组,分别设置实验组和对照组。术前将小鼠于动物房饲养一周适应环境,术前术后称量记录体重。小鼠移植瘤一般 2 w 左右即可形成,可用游标卡尺记录瘤体长短径,每周 3 次记录。一般待瘤体体积为 1 cmx1 cm 时处死小鼠,收集肿瘤接着在小鼠身上传代处理或进行其他实验验证。

小鼠实验肿瘤动物模型构建关键要细心,尤其是肿瘤细胞选择,肿瘤组织块处理上要仔细认真,这是影响模型成功建立的关键,还有移植手术时更要耐心细致,不要还没有建立就已经失败。

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