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基尔顿生物科技(上海)有限公司
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怎么准确的冻存细胞
怎么准确的冻存
细胞
一、资料
(一)仪器 1. 净化作业台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱(4℃、-20℃、-70℃) 5. 倒置相差显微镜 6. 培育箱 7. 液氮冰箱
(二)玻璃器皿 1. 吸管(弯头、直头) 2. 培育瓶 3. 玻璃瓶(250ml、100ml) 4. 废液缸
(三)塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管(10ml) 5. 15ml离心管 6. 冻存管(1~2ml)
(四)别的物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏 5. 移液枪
(五)试剂 1. D-Hanks液 2. 小牛血清 3. 培育液 4. 双抗(青霉素、链霉素) 5. 胰蛋白酶(0.08%) 6. 1NHCl
7. 7.4
%NaHCO3 8. DMSO(剖析纯)或无色新鲜甘油
二、操作过程
(一)细胞冻存
1. 制造含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培育液;
2. 取对数成长期的细胞,用胰蛋白酶把单层成长的细胞消化下来,悬浮成长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、;
3. 离心1000rpm,5min;
4. 去掉胰蛋白酶及旧的培育液,参加适当制造好的冻存培育液,用吸管悄悄吹打使细胞均匀,计数,调理冻存液中细胞的终密度为5×106/ml~1×107/ml;
5. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;
6. 在冻存管上标明细胞的称号,冻存时间及操作者;
7. 冻存:规范的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/ min;到-100℃时,则可敏捷浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中**,取出
冻存管,移入液氮容器内。
(二) 细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快消融。
2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培育液,混匀;
3. 离心, 1000rpm,5min;
4. 弃去上清液,参加含10%小牛血清培育液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培育瓶,37℃培育箱静置培育;
5. 次日更换一次培育液,持续培育。
三、注意事项
1.从增殖期到构成细密的单层细胞曾经的培育细胞都可以用于冻存,但好为对数成长期细胞。在冻存前**好换一次培育液;
2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护作业,避免**;
3.冻存和复苏好用新制造的培育液。
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