病毒构建及包装技术(一)
病毒(virus)是由一个核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质构成的非细胞形态的营寄生生活的生命体;病毒 颗粒很小、以纳米为测量单位、结构简单、寄生性严格,以复制进行繁殖的一类非细胞型微生物,多数要用电子显微镜才能观察到。
病毒载体是一种常使用于分子生物学的工具,可将遗传物质带入细胞,原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞,进行感染的分子机制。可发生于完整活体(in vivo)或是细胞培养(in vitro)中。可供利用的病毒可分为逆转录病毒、慢病毒与腺病毒。以这三种病毒为框架构建的工具载体常称之为病毒载体。
一 慢病毒载体
慢病毒(Lentivirus) 载体是以HIV-1(人类**缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因**载体。
特点:
1.区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,常用于感染难转染的细胞,如原代细胞、神经元细胞、干细胞、不分化细胞、心肌细胞、肝细胞、内皮细胞、肿瘤细胞,且效率近
2.可装载DNA片段容量高达8kb
3.目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,形成稳定遗传物质,使得目的基因在细胞中可稳定长期表达。
4.病毒载体颗粒通过包装元件和含病毒基因组质粒共转染包装细胞系。利用逆转录机制构建自我失活(SIV)的HIV-1来源的载体,一旦转移到靶细胞后,它就丧失了病毒长末端重复的转录能力,减少了产生重组病毒的机会,并避免了与启动子干扰的问题。
综上特点决定了其应用、意义:
1.用慢病毒载体携带目的基因比用质粒瞬时转染更适于稳转株构建。
2.载体带有可进行高效率的包装、转染并稳定整合进靶细胞的基因组中的序列元件,其产生滴度更高,为活体动物模型实验提供高性价比的包含目的基因的病毒液。
3.其高转导效率及整合到基因组的特点为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
二 腺病毒载体
腺病毒(adenovirus ) 腺病毒颗粒没有包膜的直径为70~90nm的颗粒,由252个壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7~9nm。衣壳里是线状双链DNA分子,约含35 000 bp,两端各有长约100 bp的反向重复序列。
腺病毒的结构蛋白在细胞核内聚集形成病毒衣壳,病毒的基因组被包装进去,形成有感染能力的病毒颗粒,并终裂解宿主细胞被释放出去,完成腺病毒的生活周期。
特点:
1.腺病毒具有宿主范围非常广,能感染增殖和非增殖各种细胞,如肝细胞、血管内皮细胞等
2.腺病毒基因组较大(36kb)绝大多数基因组均能被外源基因取代,故插入大片段外源基因的潜力大。
3.不整合到染色体中,目的基因在宿主细胞基因组外游历状态下表达,无插入致突变性,对人致病性低;
4.是瞬时转染,表达快速,容易将外源基因直接转移到靶细胞中,有效表达成活性蛋白。
5.能自行复制,有效进行增殖,产生滴度高;
6.与人类基因同源;
7.能在同一细胞株或组织中设计表达多个基因。简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中,或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。
综上腺病毒载体的特点,产生了其应用和意义:
1.应用于体内接种疫苗。用携带**调节基因或肿瘤特异抗原已近的腺病毒载体转入相应肿瘤细胞以诱导抗肿瘤**反应,可制成具有抗肿瘤活性的瘤苗。
2.应用于信号转导,基因转位,Co-IP,动物实验,干细胞研究等科研实验。
3.可以完成较高难度的克隆构建,包括具有细胞毒性作用基因的腺病毒构建,在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。
4.产生滴度高,非常适于基因**。例如:Rosenfeld等用构建的含肌糖原磷酸化酶cDNA的重组腺病毒感染肝细胞,糖原磷酸化酶活性增加46倍,提示可以对糖原蓄积**进行基因**。