ATP生物冷光反應技術應用在生乳生菌數之快速檢測
王中奇(1)(2) 任志正(1)
收件日期:87年12月19日;接受日期:88年2月4日
摘要:將生乳的生菌數以傳統平板計數與ATP生物冷光反應對同一乳樣所測得之相對吸光值(relative light unit, RLU),求出兩者對數值間的線性關係。利用此一迴歸方程式的標準曲線,可對生乳生菌數進行快速估算,全程費時6分鐘。所得之迴歸方程式y=1.29x+2.06(n=62),其相關係數為0.87(P<0.05=,顯示傳統平板計數生菌數與ATP生物冷光反應之RLU值有良好的相關性。此結果顯示可應用ATP生物冷光反應技術快速估算生乳之生菌數,並可用此技術取代傳統的美藍試驗檢測生乳菌數,讓乳品製造業者能快速地了解原料的品質,以利後段加工的進行。(關鍵語:生乳、ATP生物冷光反應、美藍還原試驗)
(1)食品工業發展研究所。
(2)Corresponding author.
緒 言
ATP生物冷光反應技術(ATP bioluminescence technique)是一種快速檢測方法,用以檢測ATP的含量。此法為美國太空總署於1960年代發展出來的技術(Griffiths, 1996),其反應原理與螢火虫體發光反應相同,在螢光素(luciferin)與螢光素(luciferase)存在下,使ATP與螢光素及螢光素作用產生螢光(Kricka, 1988)。其反應方程式如下所示:
美國太空總署當初發展此項技術的目的,是希望能用以檢測外太空是否有生命物質存在,然近來生物冷光反應卻在食品與醫藥領域中被使用。ATP廣泛存在於地球上的各類生物體中,除了微生物體內,食品中亦有多量的ATP。以細菌而言,一個菌體內ATP含量約為10-18M;**類菌體因體積較大,一個細胞則含10-15~10-16M。目前ATP生物冷光儀檢測ATP含量的極限約是10-12M,換言之,欲檢測細菌類的微生物,菌數需超過103 CFU/ml,機器才能檢出(山本,1997)。
應用此種技術檢測食品中生菌數時,需先將食品中非微生物的ATP水解(Griffiths, 1993),再將微生物體內的ATP釋放出來,與酵素反應,*後以ATP生物冷光儀檢測。倘若欲檢測食品接觸表面的清潔度,則無需去除食品中的ATP,直接測量即可。檢測結果則以相對吸光值(relative light unit, RLU)的多寡來表示ATP濃度的高低,藉此反推微生物含量和可能的食物殘留,以表示食物接觸面清潔度的情況。
目前ATP生物冷光反應技術已廣泛地應用在各項食品產業,包括生乳生菌數估算(Giese, 1997)、設備清潔度的評估(任等,1998;Seeger and Griffiths, 1994)及成品架售期的推估(Phillips and Griffiths, 1985),畜產業中屠體的污染評估(Siragusa et al., 1995),果汁產業的菌數估算(Graumlich, 1985)、製酒工業及飲料業等(王等,1998;Tydrich, 1996)。
鮮乳的營養價值很高,是人體鈣質等各類營養素*佳的來源,也因為乳品的高營養價值,不適當的集乳或貯藏條件常造成生乳的生菌數過高,因而影響鮮乳的風味與品質。業者雖了解生乳生菌數會影響成品的品質,然一般傳統微生物檢測法需耗時兩天,當得知生乳品質時,乳品早已加工至成品階段,甚至被消費者飲用完畢;目前,雖有部份工廠使用快速檢測方法測定生乳生菌數之方法,但大部份乳品工廠所使用的美藍還原試驗(methylene blue reduction test)需費時八小時,無法配合生產時效需求;其準確性亦常受光線、含氧量與操作技術等因子的影響(李等,1988),造成生乳計價時的困擾。
本實驗是以ATP生物冷光反應技術應用於生乳生菌數的快速檢測,期望能以ATP生物冷光儀所測得的RLU值,利用化學檢測取代微生物檢測,快速地估算出生乳的生菌數,並配合美藍還原試驗,比較生乳生菌數、RLU值與美藍還原試驗結果,用以評估ATP生物冷光反應在生乳生菌數檢測之適用性。
材料與方法
一. 試樣的製備
依據農委會於86年11月生乳計價會議所得之草案資料,在生乳生菌數部份,生乳計價的菌數分級是每毫升乳樣在10萬至120萬個生菌數間,分成七組。本實驗生乳乳樣由台灣北部與中部酪農戶取得,乳樣生菌數多分布在104~105 CFU/ml左右,若以本實驗所取得之乳樣進行試驗,其生菌數均接近在105 CFU/ml上下,無法得到充分的數據供應迴歸方程式的運算。經考慮生乳品質低下的原因,除集乳設備與環境污染外,多為貯藏溫度與時間不當所造成。為設計出適合本研究不同範圍的生乳生菌數含量,有的乳樣直接檢測,有的乳樣經過12~24小時,在較高溫(8~16℃)的暴露,預期找到生乳生菌數ATP含量範圍相對應之生菌數可至120萬/ml以上,再進行生乳乳樣檢測(包括生乳生菌數檢測、生物冷光反應RLU檢測及美藍還原試驗)。
二. 生乳生菌數的檢測
生菌數的測定方法是將生乳乳樣經系列稀釋後,取1 ml置於3 M薄膜試劑(3M petrifilm, 3M Health Care, St. Paul, U.S.A)上,以壓板壓平後,於37℃下培養48 hr後計數。
三. 生乳生物冷光反應RLU值檢測
生乳生物冷光反應之RLU值測定操作步驟如下:以LUMAC公司生產之Celsis Lumacâ milk bacteria kit為試驗藥劑,乳樣及藥劑均以微量吸管(Pipetman, Gilson, France)吸取。取待測生乳乳樣50m l置於lumacuvette中,加入80m l NRS(可釋出食品中非微生物的ATP),再加入20m l Somase(水解ATP的酵素,可分解添加NRS後所釋出食物中之ATP)後於室溫下震盪5 min,然後加入100m l L-NRB(用以釋出活的微生物細胞內之ATP),30 sec後再加入Lumit-PM(含有螢光素,可與ATP作用產生螢光),*後以ATP生物冷光儀(Celsis lumac biocounter M2500, Landgraaf, Netherland)讀取RLU值(Anonymous, 1997)。
四. 生乳生菌數與其ATP冷光反應RLU值之標準曲線製作
首先製作生乳生菌數的檢量線,分批檢測生乳乳樣,這些樣品的生菌數*好能均勻的分布在104~107之CFU/ml間,每個乳樣以3M薄膜試劑檢測生乳之生菌數,同時並應用ATP生物冷光反應儀測定生乳RLU值,將所得生菌數與RLU值結果(n=62)分別取對數值後,以SAS軟體(Snedecor and Cochran, 1980%