BEH HILIC色谱柱的使用指南

1. 由于BEH HILIC色谱柱不含有键合相，因此pH操作范围为1~9，操作温度上限为45℃。

2. 与其他液相色谱柱一样，BEH HILIC色谱柱在pH、压力和温度的极值下运行会缩短色谱柱使用寿命。

色谱柱平衡

1. 初次使用本色谱柱时，用50倍柱体积的50%乙腈: 50%水溶液（含最终浓度为10 mM的缓冲液）平衡色谱柱。

2. 初次进样之前，用20倍柱体积的流动相（初始条件）平衡色谱柱。

3. 如果采用梯度条件，在进样之间用8~10倍柱体积的流动相平衡色谱柱。

4. 色谱柱平衡不当会导致保留时间漂移。

流动相注意事项

1. 流动相或梯度中应始终保持至少3%的极性溶剂（例如3%水/3%甲醇或2%水/1%甲醇等）。这样可以确保ACQUITY BEHHILIC颗粒始终保持水合状态。

2. 流动相或梯度中应始终保持至少40%的有机溶剂（例如乙腈）。

3. 避免在HILIC流动相中使用磷酸盐缓冲液以防止出现析出，但可以使用磷酸。

4. 相较于甲酸或醋酸等添加剂，使用诸如甲酸铵或醋酸铵的缓冲液可获得重现性更好的结果。如果只能使用添加剂（例如甲酸等）而不是缓冲液，请使用0.2% (v:v)的浓度，而不是0.1%。

5. 为了获得理想峰形，应始终保持流动相/梯度中含有浓度为10 mM的缓冲液。

进样溶剂

1. 如果可能，进样溶剂应使用95%乙腈。极性溶剂（如水、甲醇和异丙醇）应减少到总体积的25%。

2. 通用的进样溶剂为75:25乙腈/甲醇，该溶剂可以很好地平衡分析物溶解性和峰形。

3. 请避免进样溶剂中含水和二甲基亚砜(DMSO)，这些溶剂将导致非常差的峰形。

4. 通过反相固相萃取(SPE)用乙腈置换掉水或DMSO。如果无法实现，则用有机溶剂稀释水或DMSO。

其他技巧

1. BEH HILIC色谱柱专用于保留极性非常强的碱性化合物，而对于酸性、中性和/或非极性化合物的保留性能有限。

2. 分析小分子(< 200 Da)强极性碱性化合物时，理想流速范围为0.4~0.8 mL/min。

3. 相较于Atlantis™ HILIC硅基HPLC色谱柱，BEH HILIC色谱柱在梯度分析中的保留性降低20%，在等度分析中的保留性降低35%~65%。这是因为BEH颗粒表面的硅醇残基浓度更低。

4. 切记水在HILIC分析中是非常强的溶剂。因此，必须去除或尽可能减少进样溶剂中的水。

5. 初步探索色谱条件时，可运行95%乙腈至50%乙腈的梯度。若无保留，可运行95:3:2乙腈:甲醇:水相缓冲液的等度条件。

6. 可使用诸如甲醇、丙酮或异丙醇之类的极性溶剂代替水以增强保留性能。

7. 如果使用ACQUITY UPLC系统，弱洗针液应严格按照初始流动相条件中的有机相百分比配制，否则分析物峰形或保留性能可能会受到影响。

8. 建议通过在工作流程中加入HILIC质量控制(QC)参比物质来监控系统的运行状况。