BEH Amide色谱柱分离单糖、二糖、多糖的技巧

1. 如果分离不含还原糖（如下文所示）的糖类或含糖化合物，请遵循前文的一般建议。

2. 如果分离还原糖，请查看以下信息。

3. 还原糖可以发生变旋，导致α环与β环形式的糖（差向异构体）产生，这是一种不良分离。

4. 升高温度和pH值可使差向异构体合并成一个峰：

5. 在35 ℃下使用高pH（0.2%三乙胺(TEA)或0.1%氨水(NH4OH)）和/或

6. 在高温下(> 80 ℃)使用0.05% TEA (>80 ℃)。

7. 分离还原糖（例如果糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、甘油醛等）时，请注意遵循以下建议。否则会导致这些分析物出现分裂峰（差向异构体分离）：

a. 以低流速运行（例如，在2.1 x 50 mm色谱柱上流速设置为0.10~0.13 mL/min），促进差向异构体峰合并。

b. 色谱柱较长时，可采用较高的流速（例如0.3 mL/min）。和所有LC分离一样，理想流速应通过实验来确定。

c. 向两个流动相（例如A2、B2等）储液瓶中加入三乙胺(TEA)或氨水(NH4OH)改性剂。

d. 对于单糖和/或二糖的UPLC/ELSD分离，典型的等度UPLC条件包括：

i. 含有0.2% TEA的75%乙腈(ACN)，35 °C，0.13 mL/min，2.1 x 50 mm BEH Amide色谱柱；

ii. 含有0.05% TEA的77%丙酮，85 °C，0.15 mL/min，2.1 x 50 mm BEH Amide色谱柱；

iii. 含有0.2% TEA的75% ACN，35 °C，0.2 mL/min，2.1 x 100 mm BEH Amide色谱柱。

e. 对于更复杂的糖类混合物（例如多糖）的UPLC-ELSD分离，典型的梯度UPLC条件包括（流动相A和B中都需要添加TEA）：

i. 10 min内梯度从80%变化至50% ACN（含0.2% TEA），35 °C，0.13 mL/min，2.1 x 100 mm BEH Amide色谱柱，或使用2.1 x 150 mm BEH Amide色谱柱（流速升至0.3 mL/min）；

ii. 10 min内丙酮从80%变化至55%（含0.05% TEA），85 °C，0.15 mL/min，2.1 x 100 mm BEH Amide色谱柱。

f. 对于单糖和二糖的UPLC-MS分离，典型的等度UPLC条件包括：

i. 75%ACN + 0.1% NH4OH，35 ℃，0.13 mL/min，2.1 x 50 mm BEH Amide色谱柱。

g. 对于更复杂的糖类混合物（例如多糖）的UPLC-MS分离，典型的梯度UPLC条件包括（流动相A和B中都需要添加NH4OH）：

i. 10 min内梯度从75%变化至45%ACN（含有0.1%NH4OH），35 °C，0.2 mL/min，2.1 x 100 mm

BEH Amide色谱柱。

6. 更复杂的样品混合物可能需要使用梯度条件和/或更长的UPLC色谱柱。

7. 如果在一种或多种流动相中使用了丙酮，请勿使用丙酮作为样品稀释剂或针清洗溶剂。有关样品稀释剂建议和针清洗溶剂/灌注溶剂建议的其他技巧(＃3)，请参阅进样溶剂部分。

8. 含糖/多糖/碳水化合物时，典型样品前处理建议如下：

a. 液体样品

i. 使用50:50 ACN/H2O稀释。

ii. 使用0.45μm或0.22μm针式过滤器过滤（如有必要）。

b. 固体样品

i. 称取约3g样品放入50 mL离心管中。

ii. 加入25 mL 50:50 ACN/H2O，混合均匀（机械混匀）。

iii. 在3200 rpm下离心30 min。

iv. 收集上清液，使用0.45μm或0.22μm针式过滤器过滤（如有必要）。

c. 视样品和/或分析物浓度而定，可能需要对样品进行额外稀释。

d. 更复杂并且/或者分析物浓度更低的样品可能需要额外的样品前处理步骤（例如固相萃取(SPE)）。

e. 考虑使用VanGuard BEH Amide保护柱保护UPLC色谱柱。

f. 建议通过在工作流程中加入HILIC质量控制(QC)参比物质来监控系统的运行状况。