如何选择HPLC制备柱
如何选择HPLC制备柱
沃特世制备柱应用选择快速推荐表
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应用类型 |
色谱柱品种 |
应用特色 |
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常规反相制备 |
XBridge C18：实验室必备柱 |
●BEH 杂化颗粒技术，柱耐受性与通用性更好，pH 1-12。 ●尤其适用于对胺基类化合物选择高pH 条件以获得更好的保留与载量。 ●色谱选择性与ACQUITY UPLC BEH C18 完全一致。 |
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常规反相制备 |
SunFire C18：实验室必备柱 |
●高纯硅胶C18，pH 2-8。载量大、分辨率高，在中-低pH 使用范围内通用性极（ji）佳。 ●特别适用于要求高分辨、高载量的痕量组分制备。 ●对于胺基类化合物，当需要使用低pH 条件、甚至甲酸体系时，峰形佳。 |
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常规反相制备 |
XSelect CSH C18：实验室必备柱 |
●CSH 杂化颗粒技术，柱耐受性与通用性极（ji）佳，pH 1-11。 ●切换氨水/ 甲酸反相体系时柱平衡迅速，特别适用于配MS 引导的制备纯化系统。对胺基类化合物峰形卓（zhuo）越。 ●色谱选择性与ACQUITY CSH C18 完全一致，可先用UPLC 进行pH 条件切换筛选，再放大到纯化系统进行制备。 |
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极性较大和/或疏水性强的化合物 |
Atlantis T3 |
●高纯硅胶C18，pH 2-8。有效增强对极性化合物的反相保留，三键键合C18不易流失，与100% 水相完全兼容，与MS检测完全兼容。 ●同时对强疏水性化合物的保留减弱，有助于减少有机溶剂耗量，并提高对强保留化合物的制备回收率。 ●色谱选择性与ACQUITY UPLC HSS T3 柱类似。 |
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反相无法保留的高极性化合物 |
XBridge Amide |
●BEH 杂化颗粒基质，三键键合酰胺基，耐受性与通用性极（ji）佳，pH 2-11。 ●按HILIC 原理保留高极性化合物，尤其适用于酸性化合物(如膦酸类)、中性化合物(如寡糖类或多羟基类)或混合组分样品。 ●色谱选择性与ACQUITY UPLC BEH Amide 完全一致。 |
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反相无法保留的高极性化合物 |
XBridge HILIC |
●BEH 杂化颗粒基质，无键合相，耐受性优于硅胶基质柱，pH 1-9。 ●按HILIC 原理保留高极性化合物，尤其适用于碱性化合物(如季铵盐类)。 ●色谱选择性与ACQUITY UPLC BEH HILIC 完全一致。 |
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芳香类化合物或苯基柱应用 |
XBridge Phenyl |
●BEH 杂化颗粒技术，柱耐受性极（ji）佳，pH 1-12。 ●苯基键合相对芳香类化合物有特殊的选择作用。三键键合苯基有效增强键合相耐受性与柱寿命。 ●当分离目标还具有胺基或羧基官能团时，可利用不同pH 条件下的选择性提高载量和分离度。 ●色谱选择性与ACQUITY UPLC BEH Phenyl 柱完全一致。 |
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合成肽 |
PST 肽分离技术柱： XBridge BEH130 C18 XBridge BEH300 C18 |
●BEH 杂化颗粒技术，柱耐受性与通用性好(pH 1-12)，尤其适用于肽分离时常用的TFA 体系及较高温度。 ●填料经肽混标质控，以确保批次重现性。 ●有130Å 和300Å 两种孔径可供选择。 ●色谱选择性与ACQUITY UPLC BEH130 C18 或BEH300 C18 完全一致。 |
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合成寡核苷酸 |
OST 寡核苷酸分离技术柱 |
●BEH 杂化颗粒技术，柱耐受性与通用性好(pH 1-12)，尤其适用于寡核苷酸分离纯化所需的高盐、高温条件。 ●填料经寡核苷酸混标质控，以确保批次重现性。 ●色谱选择性与ACQUITY UPLC OST C18 柱完全一致。 |
从分析柱到制备柱直接放大，常用计算公式：
放大倍数-用于估算上样量：
流速放大估算：
流速可用于计算与分析柱应用时完全相当的线性流速条件下对应于更大（da）色谱柱的体积流速。但是，合理的流速将取决于柱规格。当柱长增加、粒径减小时，柱背压会相应增加，会受到液相系统耐压性的限制。
梯度持续时间估算：
制备柱上样量预估
对于OBD制备柱的大概上样量(毫克)，梯度洗脱模式时：
1合理流速取决于柱内径。随柱长增加及填料粒径减少，柱背压增大，使用时会受到液相设备的耐压性的限制。在制备柱上的梯度持续时间，应按照与分析柱应用时相等的梯度洗脱体积与柱体积之比的倍数因子计算(计算公式见“梯度持续时间估算”公式)。
2此处进样体积数值基于50 mm柱长并使用较强溶剂溶解样品时。如增加柱长，进样体积亦可增加，但并不成正比。使用较弱强度的溶剂溶解样品，能显著提高进样体积量。
制备柱的样品载量受制于许多因素。左边所列数据仅为“平均状况下”的预估值。通常规律有：
■ 强保留的目标物载量较大
■ 样品简单时载量较大
■ 需要高分辨时载量降低
■ 样品载量受上样条件影响很大：
- 受限于样品体积
- 受限于样品溶剂的强度
■ 对于肽样品，其载量主要取决于目标肽序列以及肽样品的溶解性，建议按所列值的5-20%预估*。
装填技术与柱硬件对性能的影响
实验室规模的HPLC分离纯化对色谱工作者提出了诸多挑战，其中一个最大的挑战是制备色谱柱本身。由于柱与柱之间在性能和使用寿命上的不一致性，常常导致样品损失、重复纯化操作以及从小体积柱到大体积柱的放大能力差。沃特世科学家意识到这个问题的存在，历经三年，研究了装填工艺过程中的所有因素以及柱设计本身。在此基础上，沃特世公司于2003年推出了专利*技术OBDTM(Optimum Bed Density，最佳柱床密度)应用于沃特世制备
柱产品。(*UK专利号 # GB2408469)。
问题的根本原因就是在于，制备柱的柱床装填必须足够致密，才能在使用过程中能够承受流动相压力而仍保持稳定的柱床状态。传统的匀浆装填方法，用于分析柱规格时能够产生必需的柱床密度；但是当用于制备柱并使用较小粒径填充制备柱时，随着柱内径与长度的增加，就越来越难以达到柱长期使用仍能保持稳定耐受时所必需的柱床密度。柱床密度的优化，取决于色谱填料的特定性质与所采用的柱设计。
沃特世OBD色谱柱设计
沃特世已将高压匀浆填充与经过仔细计算的轴向压缩因素相结合，应对于柱头装填密度较小的部分。
按照制备柱OBD设计理念，并按每种填料类型和每种柱规格的立体几何学加以精心微调的实际操作工艺，就可以获得可预测的、对整个柱床长度都均匀一致的装填密度。在装填结束后的封柱过程中，沃特世柱装填操作依从仔细严格的操作流程，从而确保不会以任何不均匀的方式过度压缩或扰动柱端部分。
OBD制备柱硬件设计包括一对精心设计的分流板和化学惰性密封圈，以防止在高压操作下出现漏液情况。
OBD制备柱装配件图解
