1） **脾细胞的制备 制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c小鼠。**的方案取决于所用抗原的性质。**方案同一般血清的制备，也可采用脾内直接**法。
2） 骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。
3） 细胞融合 融合是杂交瘤技术的关键一步，细胞融合应在无菌条件下，于室温或37℃水浴中进行。瘤细胞与脾细胞之比为1：8～10，在l～2min内滴加50%PEG 1.0ml 边加边摇，静置1-2min。然后再在2～3min内缓慢滴加无血清培养液，终止反应。1000rpm离心10min。*后加含20%小牛血清的HAT培养液。将细胞混匀，接种于96孔培养板中培养，每孔加0．1ml，同时还加0．1ml的饲养细胞悬液。
4） 阳性克隆的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作**次检测，过早容易出现假阳性。检测方案应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方案应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方案有 RIA法、 ELISA法和**荧光法等。其中ELISA法*简便，RIA法*准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。
5） 克隆化 克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方案很多，而*常用的是有限稀释法。
（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方案操作复杂，效率低，故不常用。
（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。**次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于**次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。
（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。
（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。
6）细胞的冻存与复苏 细胞冻存与复苏的总原则是缓慢冷冻和快速复苏，反之则容易导致细胞内的冰晶形成。细胞株用5%～10%甘油或二甲基亚砜 (DMSO)为保护剂，并含有高浓度(40%～60%)的小牛血清，在液氮中保存。细胞悬液以10C～30C / 分的速度降温，15～20分钟后放入液氮罐的气室中，以100C / 分的速度降温至-1000C～-1500C，3～4个小时后快速放入液氮中。复苏时，将存有冷冻细胞的试管直接放入370C～400C的水浴中迅速解冻，然后在解冻的试管中快速加10ml的新鲜培养液，离心去除冷冻剂，再加含小牛血清的新鲜培养液进行培养。
7）单克隆抗体的制备 大量生产单克隆抗体的方案可分为体内和体外两大类，目前仍以体内法为主。先给小鼠腹腔注射降植烷(pristane)造成无菌性腹膜炎，7～14天后将 l×106个杂交瘤细胞悬浮于0．5 ml生理盐水中，并注入小鼠腹腔。10～14天后即可从小鼠腹水中获得高浓度的单克隆抗体。
8）单克隆抗体的纯化与保存
（1）亲和层析法 本法的成本高而效率低，故比较少用，但用本法获得的产品纯度高。
（2)中性盐沉淀法 小鼠腹水在40C下，2000×g离心20分钟，去除纤维蛋白、不溶性颗粒、以及表面的脂肪层。然后向上清中滴加等体积的pH = 7～8的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，然后静置4～6小时。离心后取沉淀物再用半饱和硫酸铵溶液洗两次。*后将沉淀溶于少量PBS中，并直接用PBS透析。
（3)离子交换层析法 小鼠腹水在40C下，2000×g离心20分钟，去除纤维蛋白、不溶性颗粒、以及表面的脂肪层后，对0.02M Tris、0.1M NaCl、pH = 8.4的缓冲液(含0.02%叠氮钠) 40C下充分透析。然后将其加至经同一缓冲液平衡的DEAE-Sepharose CL6B离子交换柱，用该平衡液洗脱，分管收集并测OD280值。一般情况下，单克隆抗体集中在**峰中。虽然有时出现**峰，但该峰常无抗体活性。
（4）凝胶过滤法 用Sephadex G200或Sephacryl S300进行层析。此法主要用于IgM类单克隆抗体的纯化。
（5)Protein A-Sepharose CL4B层析 本法适用于IgG1 和IgM类单克隆抗体的纯化。
纯化后的单克隆抗体*好保存在0.3M NaCl- 0.04%NaN3 -0.03M 6-氨基己酸的环境中。在此环境中，40C下可保存数月。有条件时在上述环境中冷冻干燥保存。
9）单克隆抗体的鉴定
（1）纯度的鉴定：可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等方案进行纯度的鉴定。单克隆抗体在SDS-PAGE上表现为一条区带，但在等电聚焦电泳上并不是一条区带。王世中等报告，纯化后的单克隆抗体在等电聚焦电泳上表现为三条区带。在等速电泳上，单克隆抗体表现为一个主峰，而多克隆抗体则表现有4～5各主峰。目前认为这一指标可作为区别单克隆抗体和多克隆抗体快速而灵敏的方案。
（2）**球蛋白及其亚型的鉴定：可用兔抗小鼠各类别及其亚型的抗血清进行鉴定。常用的方案是**扩散试验。
（3）抗原决定簇属性的鉴定：可用RIA法或ELISA法进行鉴定。用同位素(或酶)标记一个抗体，另一个不标记。当两个抗体同时与抗原作用时，如有明显的竞争现象，说明是两个不同抗原决定簇的单克隆抗体，否则就是一个。
（4）特异性的鉴定：与多克隆抗体相同，也是用交叉反应率表示。
（5）亲和力的鉴定：与多克隆抗体相同。
10）杂交瘤细胞染色体的鉴定：杂交瘤细胞应为整倍体细胞，所以染色体的数目应成倍的增加。
3．影响杂交瘤技术的因素
影响杂交瘤技术的因素主要有如下几个方面:
1）试剂和器材 所有应用的试剂如水、培养基、融合剂(PEG等)、胎牛或小牛血清等，*重要的是血清和融合剂，应用前都必须经过严格的筛选。
2）培养技术 在培养技术方面重要的是保证无菌操作，避免污染，其中*常见和*严重的是支原体污染和**污染。因此，应确保工作台、培养箱以及各种用具的清洁**。所有用具均应高压**后使用。
3）早期克隆化 克隆化应早期进行，以避免无关细胞克隆过度生长。有些克隆在低细胞密度时生长较差，此时加适量的饲养细胞、使用高质量的胎牛血清可能有帮助。在克隆化过程中，应保留所有可能有意义的细胞，以便作进一步的克隆化和检查，避免杂交瘤细胞的丢失。
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