生鲜牛乳中的脂肪球颗粒数目大且状态不稳定，在长时间的试验过程中，脂肪球极易发生簇集，进而上浮到牛乳表层并产生分层，导致近红外光谱的测量重复性变差。此外，不同温度下的脂肪球所处的状态也不相同，可能会影响近红外光谱的测量重复性，进而影响牛乳成分预测精度。
牛乳近红外漫反射光谱的测量方法
采用傅里叶变换近红外漫反射光谱仪（Bruker公司，德国）获取牛乳样品的近红外漫反射光谱。
该仪器的主要参数包括扫描范围：833~2500nm，测量模式：积分球漫反射，变量个数：2074，分辨率：8cm-1，背景扫描次数：32，样品扫描次数：32。
在采集牛乳样品的近红外光谱之前，先打开仪器预热30min以上，以便能够获取稳定可靠的光谱数据。之后打开测量软件，点击测量界面的“测量背景单通道”按钮，采集背景光谱R0作为参考光谱。背景设置好后，用1mL移液器取出2mL牛乳样品置于小烧杯中，再将镀金漫反射附件放入小烧杯内，盖于牛乳样品上，排净气泡后将小烧杯置于恒温水浴锅内进行加热。当小烧杯中的牛乳样品温度达到所需的温度并保持不变时，立即轻轻摇晃小烧杯2s左右，随后立刻将小烧杯置于光谱仪的测量槽内，并点击测量界面的“测量样品单通道”按钮进行近红外漫反射光谱的采集。
温度对牛乳近红外光谱的影响规律
不同温度下的牛乳近红外光谱曲线。在全波长范围内，任意温度下的牛乳样品均有5个明显的吸收峰，分别位于977.23、1201.95、1453.25、1795.43和1924.72nm处（25℃）。研究表明，977.23、1453.25和1924.72nm处的吸收峰主要与水中O-H官能团的吸收有关，而1201.95和1795.43nm处的吸收峰主要与碳水化合物、脂肪及蛋白质中C-H官能团的吸收有关。
为了更清楚地认识温度对牛乳吸光度的影响，将牛乳的近红外光谱分为短波（800~1100nm）、中波1100~1700nm）和长波（1700~2500nm）。结果表明，牛乳的吸光度随温度升高在不同的波段呈现出不同的变化规律。这主要由于不同位置的官能团（X-H，X可能是O，C或N）的温度敏感性不同造成的。例如，在977.23和1453.25nm处，牛乳的吸光度随温度升高而升高，并且谱峰的位置会向短波长方向移动；而1795.43nm处的峰随温度升高会向长波长方向移动。
牛乳内激发态分子的数目是温度的函数，而不同位置的吸收带又起因于牛乳内未被激发的基态分子对光的吸收，且吸收强度和位置的改变也是通过温度对偶电常数和缔合的影响引起的。温度升高会降低水中氢键的缔合作用，降低氢键簇的平均尺寸，增加游离基团的吸光度。此外，温度升高，O-H伸缩振动的谱带会向短波长方向移动。因此，977.23和1453.25nm处的峰会向短波长方向移动。
温度对牛乳近红外光谱测量重复性的影响规律
测量重复性误差δA随波长的变化与吸光度具有相似的趋势。δA在长波长（＞1400nm）的数值明显大于短波长（＜1400nm），说明在1400nm以上波段进行牛乳检测时不易获得较小的测量重复性误差，即不易获得较好的测量重复性。此外，在任意波长点处，40℃下的牛乳样品均具有*小的δA值，说明在40℃下进行牛乳近红外光谱的测量能够获得*佳的测量重复性。
在全波长范围内，牛乳样品（除25℃）的δA均有4个明显的峰，分别位于1161.56、1467.23、1867.87和2292.31nm处（45℃）。1161.56nm处的峰可能与C-H官能团的**泛音及水中O-H官能团的组合有关。1467.23nm处的峰可能与水中O-H官能团的**泛音有关。1867.87nm处的峰可能与水中O-H官能团的组合有关。2292.31nm处的峰可能与C-H官能团的组合有关。
在1467.23、1867.87和2292.31nm处，温度对δA的影响较为明显。在25~35℃之间，δA随温度升高而升高；在35~40℃之间，δA随温度升高而下降，并在40℃下达到*小，之后随着温度升高而升高，说明基于近红外光谱法的牛乳品质检测的适宜测量温度是40℃。
水作为牛乳中*重要的成分，约占牛乳总质量的85%以上。对于近红外光谱而言，水中O-H官能团和脂肪（蛋白质）中C-H官能团的伸缩振动会对δA产生影响，尤其在1400nm以上波段。乳脂肪是牛乳中密度*小，粒径*大的颗粒，其平均粒径为3~4μm。在近红外区域，乳脂肪存在相当强烈的光散射效应，影响牛乳的δA。
水在近红外波段的吸收对温度的敏感性较高，水中O-H官能团的伸缩振动易受温度影响。温度升高导致伸缩振动的羟基数目减少而自由振动的羟基数目增多，除了会产生振动光谱的偏移，也会对牛乳在1160、1450和1850nm附近的δA产生影响。
从牛乳本身的物理性质出发，作为一种天然的水包油乳液，牛乳的热力学性质不稳定。温度不同，乳脂肪所处的状态也不同。乳脂肪的熔点约为37℃，当温度低于37℃时，部分乳脂肪为固态；而当温度高于37℃时，乳脂肪全为液态。那么在30~37℃之间进行牛乳近红外光谱的测量时，由于乳脂肪状态不稳定，极易影响牛乳的测量过程，导致其测量重复性较差。
对于近红外光谱，不同温度下的牛乳样品在833~2500nm范围内均有5个吸收峰，分别位于977.23、1201.95、1453.25、1795.43和1924.72nm处（25℃）。此外，牛乳的吸光度随温度升高在不同的波段呈现出不同的变化规律。
测量重复性误差 δA 随波长的变化与吸光度具有相似的趋势，且 δA 在长波长的值大于短波长。在全波长范围内，牛乳样品的 δA 均有 4 个明显的峰，分别位于 1161.56、1467.23、1867.87 和 2292.31 nm 处（45 ℃）。在 25~35 ℃之间，δA 随温度升高而升高；在 35~40 ℃之间，δA 随温度升高而下降，并在 40 ℃下达到*小，说明基于近红外光谱法的牛乳品质检测的适宜测量温度是 40 ℃。
