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ECHO在DNA组装中的应用

ECHO在DNA组装中的应用

磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亚基ɑ（PIK3CA）是一个被广泛研究的基因，鉴于PIK3CA在癌症研究中的重要性，我们将以它为例来展示Echo 525系统驱动的微量化NEBuilder HiFi试剂盒应用。根据目标结构域，PIK3CA被拆分为四个模块化片段7，并带上C末端GLP标签。在模块化片段中设计了四个已知的致癌突变 —— R38H、 E542K、E545K和H1047R，同时我们也设计了一个野生型对照。（如下图）。

DNA组装
为更真实地模拟实际应用中面临的挑战，我们对该微量化反应体积的模块化DNA组装进行了构建设计。选择PIK3CA 癌基因，并根据结构域将其分为四个片段。这些片段或为野生型序列或含有已知致癌突变R38H、E542K、E545K和H1047R。这些片段将**入线性化的 pcDNA™3.1/Zeo (+) 哺乳细胞载体中。该Kpnl-HF酶切的载体被称为片段 5。所有片段从IDT公司定制（gBIocks®基因片段），其末端均带有 23-25 个碱基对的重叠区。随后，进行PCR扩增载体和gBIocks，以获得实验所需用量。在进行了载体DNA组件生产（pcDNA™3.1/Zeo (+) 片段5）后进行DNA纯化、定量分析和电泳观察（片段1-5）。
DNA和NEBuilder HiFi
Master Mix 阵列
使用Agilent 2200 TapeStation 分析DNA 浓度，并将DNA稀释至组装所需浓度。然后，将稀释好的DNA转移至经Echo验证过的低死体积384微孔板（384 LDV Plus）。另外将NEBuilder HiFi 2x Master Mix 分装入384 LDV Plus板。对于复杂组装，NEBuilder HiFi 试剂盒的建议组装体积为 20 uL，每个片段的加入量为 0.5 pmol。根据以往echo结果， 500 nL 反应体系（每个片段1.25 fmol）具有高稳定性。按照该条件完成体系构建和封膜后，于Applied Biosystems ProFlex PCR 50°C孵育1小时。待PCR反应板冷却至4°C后转化到 NEB 10B 大肠杆菌细胞中。之后进行转化/质粒构建，大肠杆菌铺板。

gBLOCK® 扩增引物
模块化 DNA 组装所使用的试剂体积。这些试剂全部通过 Echo 525 从 384 LDV Plus 板上进行移液。
菌落qPCR质控
针对组装质粒构建物的4个不同连接区，Echo 525 移液器可**地将 250 nL 的细胞悬液分滴至4个10 uL qPCR反应体系中，作为质粒组装的一种质控方式。对于4种反应，分别配制含有扩增子引物对和 LightCycler® 480 SYBR Green I Maser 核酸染料的qPCR反应母液。首先将母液分装到带条形码的 Bio-Rad Hard-Shell* Skirted 384孔PCR 板中，1000 x g离心1分钟。随后，采用P10枪头挑选单克隆到Echo Qualified 384 孔聚丙烯微孔板 2.0 （384孔PP板）中，接种在 50 uL diH20。对装有细胞的384孔 PP 板封膜，置于Eppendorf MixMate® 2000 RPM 2分钟涡旋震荡。从该混合物中，使用Echo校准 384PP_AQ_BP，将 250 nL 的细胞悬液喷射到384孔PCR 板的相应qPCR反应母液中。然后，光学薄膜密封qPCR板， 2000 RPM涡旋震荡2分钟， 1000 x g 离心1分钟。接下来，根据表7中实验条件进行菌落qPCR检测。同时具有3个连接取qPCR cp值（与氨苄青霉素对照匹配）的菌落被认为是阳性组装物，将对其进行高通量测序。
菌落qPCR反应体积
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利用更小规模的DNA组装方法能够减少合成生物学研究成本，加速实验设计、构建、测试的过程。在本次实验中，NEBuilder HiFi利用ECHO 525每次移液25纳升进行致癌基因的五个模块片段的组装。与NEBuilder HiFi试剂盒的建议量相比，使用ECHO 525进行组装减小了40倍的反应体系。按照40倍减少的反应计算，500纳升的反应体系只需要1.25fmol DNA。我们可以看到，使用ECHO 525能够以低成本的反应体系获得高质量的DNA构建，减少DNA组装成本，扩展了基因工程的方法，为科学家探索更广泛的生物学领域助力。

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