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用凝胶电泳分离蛋白质样品的电荷效应浓缩效应-多功能混匀仪技术文章
用凝胶电泳分离蛋白质样品的电荷效应浓缩效应-多功能混匀仪技术文章
用凝胶电泳分离蛋白质样品的电荷效应浓缩效应-多功能混匀仪技术文章
电荷效应 蛋白质混合物在界面处高度浓缩,堆积成层,并形成一个狭窄的高浓度蛋白质区。但由于每种蛋白质分子所载的有效电荷不同,故泳动率亦不同。若样品组分的分子量相等,则各种蛋白质样品经分离胶电泳后就以圆盘状或带状按电荷顺序一个一个地排列起来。
浓缩效应 当样品胶和浓缩胶选用pH6.7 Tris/HCl缓冲液,电极液选用pH8.3 Tris/甘氨酸缓冲液时,电泳初期,盐酸几乎全部离解释放出氯离子(C1
—
),甘氨酸(pi为6.0、pK为2.34、pKa为9。7)贝g只有1%一0.1%解离释放出甘氨酸根离子(NH
2
—CH
2
—COO—),而酸性蛋白质一般在浓缩胶中解离后为带负电的离子。这3种离子带有相同类型的电荷,并同时向正极移动,其有效泳动率按如下次序排列:mCl
—
·aCl
—
>m蛋
—
·a蛋
—
>m甘
—
·a甘
—
(式中m代表泳动率,a代表离解度,ma代表有效泳动率)。根据有效泳动率,把泳动率*大的Cl
—
称为快离子(又称前导离子):把*小的NH
2
—CH
2
COO—称为慢离子(又称尾随离子)。在电泳刚开始时,3层凝胶(样品胶、浓缩胶和分离胶)中都含有快离子,只有电极缓冲液中含有慢离子。电泳进行时,由于快离子的泳动率*大,因此很快超过蛋白质,于是在快离子后形成一个离子浓度低的区域,即低电导区。电场强度与电导率成反比关系:
E=1/η(伏/厘米)
公式中E代表电场强度,I代表电流强度,刀代表电导率。这种环境使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当电场强度和泳动率的乘积彼此相等时,3种离子移动速度相同(即v=mE,移动速度=泳动率X电场强度)。快离子和慢离子移动速度相等的稳定状态建立之后,则在两者之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面,也就是说,在高电场强度区和低电场强度区之间形成一个迅速移动的界面。由于样品蛋白质的有效泳动率恰好介于快慢离子之间,因而它就聚集在这个移动界面附近,且浓缩为一个狭小的中间层(浓缩300多倍)。样品被浓缩的程度与其本身浓度无关,而起作用的因子是氯离子的浓度。当氯离子浓度高时,样品被浓缩的程度亦高。
转自生命科学论坛
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