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多重PCR的一些体会-多功能混匀仪技术文章
多重PCR的一些体会-多功能混匀仪技术文章
多重PCR的一些体会-多功能混匀仪技术文章
这些年一直做一些多重PCR,对多重PCR,有一些自己的小体会,现写出来与大家一道共享并期待与大家的交流。
实际**的说,高通量核酸扩增技术一直是大规模核酸样品检测分析的瓶颈。
现在的样品检测比如基于生物芯片平台的核酸样品检测,都是基于同时对成百上千个样品、上百上千个靶基因位点进行,
很不幸的是,现有的核酸扩增技术,当然主要是PCR技术,现有的多重PCR是远远不能满足需求的。
因此,现在又很多人都在致力于新型高通量核酸扩增技术的开发,这类方法往往采用了固相分离技术,当然还有一些。
好了,今天主要谈多重PCR技术。
(1)我的多重PCR入门
在开始多重PCR设计之前,我的单重PCR已经算是做得非常好了,对PCR原理,PCR的数学模型,PCR的引物设计以及各种问题
分析已经非常熟悉。
后来由于实验需要,开始涉及多重PCR,在实验开始之前,这边文献《
多重PCR的经典之作:Multiplex PCR- Critical Parameter
》
(文献可以从本论坛下载:
http://www.biomicroarray.com/for ... &tid=205&fromuid=85
)我认真研读多
遍,并做了详细笔记。应该说,这篇文献对于初涉及多重PCR来说,是个非常好的指导之作,建议认真认真再认真的阅读。有了
把握之后,就开始了多重PCR的引物设计。
**次设计的是个四重PCR,四队引物的设计花了我不少时间,为了保证四队引物的相互兼容性以及扩增效率的一致性,需要对
四队引物以及引物对之间逐一配对分析,这里没有巧办法,所需只是耐心和时间而已。
引物设计合成后,开始了配液,当时采用的PCR试剂都是各个单体,不像现在,大家都习惯用商业化的mix,包括 10x Buffer里
都是不含MgCl2或MgSO4的,各个试剂之间安装均匀设计表,进行梯度设计。通过PCR后电泳,找出*佳的试剂梯度组合。**
次的实验还算比较顺利,可能是由于前期工作准备得比较好。呵呵,当时看到电泳的四个清晰条件逐次排列,心情是非常激动
的。
(2)后期的多重PCR
翁曰:无他,但手熟尔。
此言真是天大的一句大实话。
多重PCR设计多了后,对立面的道道有了一些自己的理解。也开始把PCR简化了。到现在,哪怕是八重九重,我也是按照自己的套路来进行:精心设计引物,试剂配比吗,基本不大动了,顶多增加酶量。呵呵,运气还比较好,成功率算是非常高的。
(3)我的多重PCR实验套路
1、引物设计。
一般采用primer 5或primer 6进行引物设计。
多重引物的设计有几个原则:
(a)各个引物对的Tm等参数尽量接近
(b)各个引物对应本本身就是一对优良的单独的引物对,不要存在严重的二级结构比如发夹,dimers以及误引发。
(c)多重体系中的各个引物,应均按两两组合配对检查两个引物之间会不会存在严重的dimers,记住,是每条引物都要与其他引物配对检查。
2、试剂配比。
一般情况下,Buffer、离子浓度、dNTPs是可以按照单管PCR的加入量进行的,他们的量,是足够的。大家可以自己去计算下。
酶量,我的建议是要按照单管加入量的1.5倍加入。
3、各个引物对的加入
(a)老老实实先完成各个引物对的单管扩增,保证单管扩增OK!,这步解决不了,先启动下一步。
(b)在多重PCR配液中各个引物对可以按照单管扩增的量(建议采用终浓度0.4uM)等量加入,然后进行PCR,电泳或其他方法观察各个引物对所扩增的产物的强度。扩增弱的,下一步增加该对引物的加入量,扩增太强的,下一步可适当降低该对引物的加入量。
4、PCR扩增条件
没有太大讲究,72度延伸时间足够即可!
转自生命科学论坛
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