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基因基因靶向技术TALE简介-多功能混匀仪技术文章
基因基因靶向技术TALE简介-多功能混匀仪技术文章
基因基因靶向技术TALE简介-多功能混匀仪技术文章
TALE(transcription activator-like (TAL) effector)基因基因靶向技术可以识别任意设计的DNA序列,配合核酸酶、转录因子或同源重组序列,可实现生物体内的基因靶向操作,包括基因敲除、同源重组和基因激活等。TALE技术比ZFN更加灵活,更容易设计出有效靶点,现已应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象,使基因敲除等操作变得更加简单可控。
TALE原理
AL的核酸识别单位为重复34个恒定氨基酸序列,其中的12、13位点双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系,即NG识别T,HD识别 C,NI识别A,NN识别G。为获得识别某一特定核酸序列的TALE,只须按照DNA序列将相应TAL单元串联克隆即可。由于物种基因组大小的不同,选择的特异序列长度也不同,对于哺乳类动物包括人类,一般选取16-20bp的DNA序列作为识别靶点。组成的TALE识别模块与核酸酶或转录激活因子相连,导入细胞即可实现基因敲除或激活。
TALEN基因敲除
将识别特异DNA序列的TALE与内切核酸酶FokI偶联,可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALEN。而且FokI需形成2聚体方能发挥活性,大大减少了随意剪切的几率。在实际操作中,需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻(间隔13-22碱基)的靶序列(一般16-20个碱基)分别进行TAL识别模块构建。 将这两个相邻靶点识别模块(分别)融合克隆到FokI的N-末端,形成真核表达载体,得到TALEN质粒对。
将TALEN质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALEN质粒对共转入细胞后,表达的融合蛋白,分别与靶位点特异结合, 由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近, 形成二 聚体,发挥非特异性内切酶活性,在两个靶位点之间剪切DNA, 形成DSB(Double-Strand Breaks),诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过NHEJ(Non-homologous End Joining)修复DNA, 在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基,造成移码,形成目标基因敲除突变体。
TALE转录激活
将识别特异DNA序列的TALE与转录因子激活区域VP64(VP64 Activation Domain )融合,可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA. 在实际操作中,需在目标基因的启动子上游选取靶序列(一般12-18个碱基),构建TAL识别模块。 将识别模块TALE融合克隆到VP64的N-末端,形成真核表达质粒TALEA。将TALEN质粒转入细胞中, 表达的融合蛋白结合启动子附近的特异DNA序列, 并通过VP64激活区域与Pol II 结合,从而激活基因的转录,提高了内源目标基因的表达。
TALE同源重组
当通过TALEN产生DSB后,若能提供同源修复模板,细胞可通过同源重组方式修复DNA,因此可以对内源DNA做更精细的操作, 如点突变、保守区域替换、 N端或C端加标记等。
转自生命科学论坛
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