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冻干法复性蛋白 -混匀仪技术文章
冻干法复性蛋白 -混匀仪技术文章
冻干法复性蛋白 -混匀仪技术文章
蛋白复性仪是受到海水冻结淡化成淡水这一自然现象启发而研制。溶液中溶质盐的溶解度会受到温度的影响,由于变性盐(尿素,盐酸胍等)在低温下溶解度下降逐渐结晶析出脱离溶液,同时做到了减低分子热运动和减低溶液变性盐浓度这两个至关重要的变性因素。结晶的速度可以通过温度的下降速度来进行控制,从而营造了一个蛋白复性的绝好的条件-即低温,和平滑的变性盐浓度下降梯度。同时也考虑到肽链和变性盐的理化特性,辅助以电场,用以调整肽链在溶液中的排列状态,限制分子运动状态,防止肽链相互聚集缠绕,进而提高蛋白质的复性效率(甚至可以在基因合成阶段在肽链两端加上带电残基序列或者偶联带电基团,用以增强电场的“束缚”效果)。同时也可在复性液中辅助以一定浓度的防冻剂(DMSO,甘油,乙二醇,乙醇等)和复性促进剂(小分子伴侣,环糊精,甘氨酸等),氧化还原剂,缓冲盐等,用于防止冻结对蛋白质活性的损伤提高复性率。
不加电场的具体实验过程:塑料离心管装液体包裹上几层毛巾(不要扣盖,管口覆盖两层纱布,防止蛋白粉末在冻干过程中逸散)垂直放置-80冰箱缓冻过夜,早上先开冷冻离心机充分预降温半小时,然后直接取出试管(包着毛巾就可以,防止融化)迅速入冷冻干燥机抽干一上午,过筛获取蛋白质干粉,蛋白干粉水溶后如果采用CD方式的话,当天下午也就可能知道结果了。
变性剂配方没有什么特别的,只要在您实验室常用配方里面加上10%的DMSO即可。关键就是缓冻,和**天早上保证液体处于冰冻状态迅速进入已经充分预冷的冷冻干燥机。建议做几个浓度梯度,因为如果蛋白量太少的话,过筛很可能得不到足够蛋白粉末。
再者,对于得率问题认为不必纠缠,毕竟商业生产上,析出的盐肯定是滚动使用的,上面挂的少许蛋白也不会浪费……
转自生命科学论坛
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