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ELISA知识讲座之三-混匀仪技术文章
ELISA知识讲座之三-混匀仪技术文章
ELISA知识讲座之三-混匀仪技术文章
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。前文(2.2)已述,ELISA中有三个必要
的试剂:**吸附剂、结合物和酶的底物。
完整的ELISA试剂盒包含以下各组分:
(1)已包被抗原或抗体的固相载体(**吸附剂);
(2)酶标记的抗原或抗体(结合物);
(3)酶的底物;
(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中),参考标准品和控制血清(定量测定
中);
(5)结合物及标本的稀释液;
(6)洗涤液;
(7)酶反应终止液。</P><P auto 0cm">3.1 **吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温(2~8℃)干燥的条件下一般可保存6个月。有些
不完整的试盒,仅供应包被用抗原或抗体,检测人员需自行包被。以下简述固相载体和包
被过程。</P><P auto 0cm">3.1.1 固相载体
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器,不参与化学反应。可作ELISA中载
体的材料很多,*常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能,抗体或蛋
白质抗原吸附其上后仍保留原来的**学活性,加之它的价格低廉,所以被普遍采用。聚
苯乙烯为塑料,可制成各种形式。
ELISA载体的形状主要有三种:微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板*为常
用,专用于EILSA的产品称为ELISA板,国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。为便
于作少量标本的检测,有制成8联孔条或12联孔条的,放入座架后,大小与标准ELISA板
相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测,并可在特制的比色计上迅速读出
结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测,包括加样、洗涤、保
温、比色等步骤,对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后,其吸附性能特别是
对**球蛋白的吸附性能增加,应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多,但用于间接
法测抗体时空白值较大。
良好的ELISA板应该是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之间、同一板各
孔之间、同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差
别,各种产品的质量差异很大,因此,每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。
常用的检查方法为:以一定浓度的人IgG(一般为10ng/ml)包被ELISA板各孔,洗涤后每
孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体,保温后洗涤,加底物显色,终止酶反应后,分
别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件,使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的
平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差,应小于10%。
与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为ELISA固相载体,聚氯乙烯的特点为质软板
薄,可剪割,价廉,但光洁度不如聚苯乙烯板,孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋
白质的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高。
为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣,可应用如下的试验:用其他**学测定
方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本,将它们进行一系列稀释后,在不同的固相载体
上按预定的ELISA操作步骤进行测定,然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结
果差别*大,这种载体就是这一ELISA测定项目的*合适的固相载体。
在ELISA中,用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm的圆珠,表面经磨砂处理后吸附
面积大大增加。ELISA板孔的吸附面积约为200mm2,小珠均为1000mm2,将近ELISA板
孔的5倍。吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。再者,球型小珠的表面弧
度更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于*佳反应状态,因此珠式
ELISA的反应往往更为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底,使用特殊的洗涤器,
使小珠在洗涤过程中滚动淋洗,其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由于磨砂工艺的难
度较大,小珠的均一性较差。
小试管作为固相载体也有较大的吸附表面,而且标本的反应量也相应增加。板式及珠
式ELISA的标本量一般为100-200ul,而小试管可根据需要加大反应体积,标本反应量的增
加有助于试验敏感性的提高。小试管还可以当作比色杯,*后直接放入分光光度计中比
色。
也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为ELISA固相载体的。其优点是表面
积极大,反应在悬液中进行,其速率与液相反应近似。以含铁的磁性微粒作为ELISA固相
载体,反应后用磁铁的吸引进行分离,洗涤方便,试剂盒一般均配以特殊仪器。</P><P auto 0cm">3.1.2 包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。换言之,包被即是抗原或抗体结合到固
相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分
子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性
的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同
的,大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表
面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力,其联结多发生在Fc段上,抗体结合点暴露
于外,因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方
法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时,抗原与固相载体的直接吸附可使抗原
决定簇不能充分暴露,在这种情况下,直接包被效果不佳,可以采用间接的捕获包被法,
即先将针对该抗原的特异抗体作预包被,其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结
合在固相上的抗原远离载体表面,其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相
抗体的亲和层析作用,包被在固相上的抗原纯度大大提高,因此含杂质较多的抗原也可采
用捕获包被法(见2.2.4),试验的特异性、敏感性均由此得以改善,重复性亦佳。间接包
被的另一优点是抗原用量少,仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体
上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如,在检测抗DNA抗体时,需用DNA作为包
被抗原,而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射
(例如30W紫外灯,75cm照射12小时),以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白
质,如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被,也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系
统作间接包被,即用亲和素先包被载体,然后加入生物素化的DNA,这种包被方法均匀、
牢固,已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA
板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。抗心
磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。</P><P auto 0cm">3.1.3 包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三
大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等,须经提取纯化才能作包被用。如
HBsAg可以从携带者的血清中提取,一般的**和病毒抗原可以从其培养物中提取,蛋白
成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等(例如AFP从脐带血或胎肝中提取)。重组抗原
是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原,多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的
优点是除工程菌成份外,其他杂质少,而且无传染性,但纯化技术难度较大。以大肠杆菌
为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份,用于ELISA,在反应中可出现假阳性,
因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能
用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒(HCV)尚不
能培养成功,而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCV ELISA中所用包被
抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中,不少重组抗原
如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分
子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决
定簇,纯度高,特异性也高,但由于分子量太小,往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原
的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质(BSA)等偶联,借助于偶联物与固
相载体的吸附,间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与
其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇,因此在受
检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外,某些微生物发生变异时往往发
生抗原结构变化,在这种情况下,用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。</P><P auto 0cm">3.1.4 包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性,可取材于抗血清或含单克隆抗体的
腹水或培养液。如**用抗原中含有杂质(即便是极微量的),在抗血清中将出现杂抗
体,必须除去(可用吸收法)后才能用于ELISA,以保证试验的特异性。抗血清不能直接
用于包被,应先提取IgG,通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐
析粗提的IgG已可用于包被,高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提
高试验的敏感性,则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中
单抗的浓度较高,特异性亦较强,因此不需要作吸收和亲和层析处理,一般可将腹水作适
当稀释后直接包被,必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意,一种单抗仅针对
一种抗原决定簇,在某些情况下,用多种单抗混合包被,可取得更好的效果。</P><P auto 0cm">3.1.5 包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度,包被的温度和时间,包被液的pH等应根据试验的特点和材
料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液,也有用
pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入
包被液后,在4-8℃冰箱中放置过夜,37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被
的*适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化,每批材料需通过实验与酶结合物的
浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。</P><P auto 0cm">3.1.6 封闭
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体
包被时所用的浓度较低,吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙,封闭就是让大量不相
关的蛋白质充填这些空隙,从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手
续与包被相类似。*常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白,也有用10%的小牛血
清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂,其*大的特点是价廉,可
以高浓度使用(5%)。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用,但由于奶
粉的成份复杂,而且封闭后的载体不易长期保存,因此在试剂盒的制备中较少应用。
封闭是否必要,取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA固相均需
封闭,封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来,双抗体夹心法,只要酶标记物是高活
性的,操作时洗涤彻底,不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时,
因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面,业已起到了类似封闭剂的作用。
但在间接法测定中,封闭一般是不可少的(见2.2.2)。包被好的ELISA板干燥后放入密
封袋或锡袋中,在低温可保存数月
转自生命科学论坛
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