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PCR反应五要素-混匀仪技术文章
PCR反应五要素-混匀仪技术文章
PCR反应五要素-混匀仪技术文章
引物是
PCR
特异性反应的关键,
PCR
产物的特异性取决于引物与模板
DNA
互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板
DNA
序列,
就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用
PCR
就可将模板
DNA
在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则:
①引物长度:
15-30bp
,常用为
20bp
左右。
②引物扩增跨度:
以
200-500bp
为宜,特定条件下可扩增长至
10kb
的片段。
③引物碱基:
G+C
含量以
40-60%
为宜,
G+C
太少扩增效果不佳,
G+C
过多易出现非特异条带。
ATGC
*好随机分布,避免
5
个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是
3'
端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物
3'
端的碱基,特别是*末及倒数**个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致
PCR
失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,
被扩增的靶序列*好有适宜的酶切位点,
这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:
每条引物的浓度
0.1
~
1umol
或
10
~
100pmol
,以*低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种
Taq DNA
聚合酶供应,
一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的
PCR
反应约需酶量
2.5U(
指总反应体积为
100ul
时
)
,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
dNTP
的质量与浓度
dNTP
的质量与浓度和
PCR
扩增效率有密切关系,
dNTP
粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP
溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以
1M NaOH
或
1M Tris
。
HCL
的缓冲液将其
PH
调节到
7.0
~
7.5
,小量分装,
-20
℃冰冻保存。多次冻融会使
dNTP
降解。在
PCR
反应中,
dNTP
应为
50
~
200umol/L
,尤其是注意
4
种
dNTP
的浓度要相等
(
等摩尔配制
)
,如其中任何一种浓度不同于其它几种时
(
偏高或偏低
)
,就会引起错配。浓度过低又会降低
PCR
产物的产量。
dNTP
能与
Mg2+
结合,使游离的
Mg2+
浓度降低。
模板
(
靶基因
)
核酸 模板核酸的量与纯化程度,是
PCR
成败与否的关键环节之一,传统的
DNA
纯化方法通常采用
SDS
和蛋白酶
K
来消化处理标本。
SDS
的主要功能是:
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,
SDS
还能与蛋白质结合而沉淀;
蛋白酶
K
能水解消化蛋白质,特别是与
DNA
结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于
PCR
反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于
PCR
扩增。
RNA
模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶
K
法,要防止
RNase
降解
RNA
。
Mg2+
浓度
Mg2+
对
PCR
扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的
PCR
反应中,各种
dNTP
浓度为
200umol/L
时,
Mg2+
浓度为
1.5
~
2.0mmol/L
为宜。
Mg2+
浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低
Taq DNA
聚合酶的活性,使反应产物减少。
PCR
反应条件的选择
PCR
反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置:
基于
PCR
原理三步骤而设置变性
-
退火
-
延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链
DNA
在
90
~
95
℃变性,再迅速冷却至
40
~
60
℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至
70
~
75
℃,在
Taq DNA
聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因
(
长度为
100
~
300bp
时
)
可采用二温度点法,
除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用
94℃
变性,
65
℃左右退火与延伸
(
此温度
Taq DNA
酶仍有较高的催化活性
)
。
①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致
PCR
失败的*主要原因。一般情况下,
93
℃~
94
℃
min
足以使模板
DNA
变性,若低于
93
℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或
PCR
产物完全变性,就会导致
PCR
失败。
②退火
(
复性
)
温度与时间:退火温度是影响
PCR
特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至
40
℃~
60
℃,可使引物和模板发生结合。由于模板
DNA
比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于
20
个核苷酸,
G+C
含量约
50%
的引物,
55
℃为选择*适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:
Tm
值
(
解链温度
)=4(G+C)
+
2(A+T)
复性温度
=Tm
值
-(5
~
10
℃
)
��� 在
Tm
值允许范围内,
选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,
提高
PCR
反应的特异性。复性时间一般为
30
~
60sec
,足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间:
Taq DNA
聚合酶的生物学活性:
70
~
80
℃
150
核苷酸
/S/
酶分子
70
℃
60
核苷酸
/S/
酶分子
55
℃
24
核苷酸
/S/
酶分子
高于
90
℃时,
DNA
合成几乎不能进行。
PCR
反应的延伸温度一般选择在
70
~
75
℃之间,常用温度为
72
℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR
延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般
1Kb
以内的
DNA
片段,延伸时间
1min
是足够
的。
3
~
4kb
的靶序列需
3
~
4min
;扩增
10Kb
需延伸至
15min
。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。
转自生命科学论坛
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