2. **概念的离心式实时定量PCR仪 为了克服平板式定量PCR温度均一性差的缺点，聪明的研究人员又开发出**概念的离心式实时定量PCR仪，以Roche罗氏的Lightcycle和Corbett的Rotor-gene为代表。PCR扩增样品槽被巧妙地设计为离心转子的模样，借助空气加热和转子在腔内旋转，转子上每个孔都是“等位”的，几乎无差别，很好的解决了每个样品孔之间的温度均一性的关键问题——Corbett的Rotor-gene样品间温度差异小于±0.01℃，大程度地保障了标准曲线和样品之间条件的一致性。利用空气做加热介质的优点在于能实现与反应体系无缝接触，接触面积大且加热均匀。虽然有竞争对手批评空气介质比热小，但事实上Roche的Lightcycle 2.0却是目前升温速度快的定量PCR仪，可以达到20℃/秒！Corbett的Rotor-gene也可以达到5℃/秒(样品实际升温速度达到2.5℃/秒)，优于多数的平板式PCR仪。借助旋转离心力还可以随时将可能凝在管壁和盖子上的液滴离心到管底而无需热盖；还可以将酶加在管盖上，升温后离心到管底与反应体系混合，实现“机械的热启动功能”。由于升温速度快，对于常规需要2个多小时完成的定量PCR反应，Roche的LightCycler仅需20—30分钟即可完成，可以大大节约时间和提高工作效率。这一点对于研究人员来说极为有用，因为你不再需要等2个多小时才能看实验结果了，或者换句话来说，2个多小时你可以做4—5轮定量实验了。由于转子上的样品孔是旋转可移动的，因而离心式荧光检测系统可以固定激发光源和荧光检测器，随时检测旋转到跟前的样品管——由于每个样品管在检测时距离检测器和激发光源的距离都是“等价”一样的，使用的是同一个检测器和激发光源，有效减少不必要的系统误差。固定的结构使得仪器运行更稳定，使用寿命更长；离心式定量PCR都是逐个检测样品的，所以大多采用了长寿的LED（发光二极管）冷光源，运行前无须预热，无须校正；系统检测重复性也更好。离心式定量PCR仪的缺点主要是离心的转子小，能容纳的样本量有限，由于是离心式转子，常规的96孔板和条形管就不适用，有的还需要特殊的消耗品，增加使用成本。当然离心式定量PCR仪不可能带梯度功能。 Roche的Lightcycler刚推出的时候确实让人眼前一亮！现在Lightcycler2.0拥有令人心动的优点—— 快速：利用空气动力学原理，20－30分钟内完成30－40个循环。控温准确：变温速率高可达20℃/秒，温差≤±0.3°C 多波长检测：可同时在530、640及710nm三个通道进行检测，实现同管检测两个项目或设立检测项目的外对照和内对照。此外动态检测范围达10个数量级，而无须将样品稀释；具有熔点曲线分析功能可以鉴别基因型、检测点突变、检测非特异性扩增，具多种检测模式如Taqman探针、荧光染料SYBR Green I检测、序列特异杂交探针等；探针及引物设计方便，杂交探针及引物设计的限制少，而且亦可方便地选用合适大小的扩增子（100-1000bp）。但是Lightcycler需要使用特定的毛细管作为样品管，这在某种程度上提高了消耗成本，也不方便作为常规PCR仪使用。 Corbett的Rotor-Gene也是离心式的定量PCR仪。在的角度上Corbett当然不如Roche罗氏在那样家喻户晓，之所以特别提到这个产品，确实是因为Corbett的设计有独到之处。比如Corbett的Rotot-Gene3000标准型是真正独立的4通道(可建立新通道)，4个独立LED激发光源(470nm/ 530nm/585nm/625nm)保证少的光谱交叉 (0.99935)。由于转子在反应过程之中一直以恒定的低速旋转，使得样品间的温度均一性(±0.01℃/秒)，同一热反应室完全相同的反应条件，同一光学通路完全相同的测量通道，每标本每循环检测32次，满足高精度和一致性要求。Rotot-Gene3000了36 x0.2ml和72x0.1ml两种转子，检测是通过薄壁管侧壁而非管底进行的，因而可以使用普通的0.2ml PCR管，并允许在试管盖上标记，这降低了使用成本。Rotot-Gene3000的温控速度不如LightCycler，但优于多数的固定加热模块的机型，能达到5℃/秒(管内实际升温速度达到2.5℃/秒)。Corbett还有一个光学变性——让待扩增样品预先进行一次熔解曲线程序，检测荧光染料信号大小的变化，找到代表全部双链DNA解链的峰值对应温度，在其后的反应中就无需总是将变性温度设为94度，也不需要延长孵育时间。这个使得反应过程大大缩短。Rotot-Gene主要的问题也是可容纳的样品数量少，只能靠反应速度快，同样的时间可以多运行几轮反应来弥补。对于大量样品的实验室，Corbett同时还定量PCR反应自动加样系统，不单可以和自家的Rotor-Gene配套使用提高工作效率和均一性、**性，也可以配套Roche和ABI的定量PCR仪。这样就不用担心加样累坏了。(待续)
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