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菌落原位杂交技术基本原理-仪器结构|技术参数|功能特点|规格

对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于**个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
　　1、材料：待检测的**平皿，已标记好的探针，硝酸纤维素滤膜等。
　　2、设备：恒温烤箱，恒温水浴，台式高速离心机等。
　　3、试剂：
　　(1)LB固体培养基。
　　(2)0.5mol/L NaOH。
　　(3)1mol/L Tris·Cl。
　　(4)1.5mol/L NaCl。
　　(5)0.5mol/L Tris·Cl。
　　(6)预洗液：5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
　　(7)预杂交液：50%甲酰胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO(甲酰胺可不用)。
　　(8)其余试剂：与Southern杂交相同。
　　4、操作步骤：
　　1. 将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上：
　　(1) 在含有选择性***的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。
　　(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性***但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。
　　(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的**菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。
　　(4) 用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜。

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