在单克隆抗体纯化中，为了获得所需高质量的抗体，一般使用两步或三步层析步骤。通常，用于三步工艺的层析介质为Protein A→阳离子交换→阴离子交换；用于两步工艺的层析介质为Protein A→Capto adhere（多模式离子交换）。所有的单克隆抗体（Mabs）都有一些相似的特性，所以可以使用同一个平台方法纯化。请注意，平台并不意味着相同的工艺，它只是表示工艺的某些方面不需要从头开始开发，因为可以利用以前单克隆抗体工艺开发经验。 本次讨论的目的是提出一种纯化工艺，它可以用于哺乳动物细胞生产的大多数Mabs的纯化工艺。这里我们介绍一种基于MabSelectTMSuRe层析介质做工艺开发的一般起始建议（未优化）。 MabSelectTMSuRe 是一种Protein A层析介质，耐受苛刻和具有成本效益的CIP程序，即0.1-0.5 M NaOH。 用于工艺开发的推荐途径是使用高通量工艺开发(HTPD)--使用PreDictor™96孔板可以在短时间内评估大量的层析参数（参考文献1）。然后佳工艺参数被放大，即HTPD→实验室规模→中试车间→生产。这种方法了大量的对于Quality by Design (QbD)方法尤其有用的数据。甚至当使用HTPD时，下一个表格中的一些信息可以作为起点使用。
大约总的循环时间*** ~ 17CV x 2.4 min/CV + 11CV x 3.4min/CV + 2 CV x 7.5 min/CV ~ 95min ~ 1.6小时。即使你做两次，总时间大约为3.2小时。没有生产中的限速步骤。 基本的简化工艺开发 上样准备-样品在上样到MabSelect SuRe层析柱前必须经过过滤。至少必须使用无菌过滤器；另外，在无菌过滤前可以使用吸附深度过滤器。在细胞培养物收获后，应该尽快完成运行。在细胞培养物运行前需要被保存的情况，应该经过无菌过滤并保存在4℃，或者冷冻保存（如可能）。 Run #0–空白运行-为了去除非共价固定的配基，应该在新的MabSelect SuRe层析介质上轮运行前进行空白运行，从而减少层析期间的配基泄露。上面列出的层析方法的所有阶段应使用两种变化-首先，在上样阶段应使用平衡缓冲液（即不含蛋白质），其次，空白运行的洗脱阶段应被设置为3个柱体积，且不受监测功能的控制。 Run #1 –上样条件-下一个实验应该运行以确定MabSelect SuRe层析柱在2.4-4.8分钟保留时间内对你的Mab的动态结合载量（DBC）。按照上述程序并使层析柱过载达到50 g/L，收集穿透组份，然后测定穿透组份中的Mab浓度，并计算5%穿透。 Run #2–设置上样条件到5%穿透时80%动态载量，然后遵循上述所有步骤。如果这轮运行产生可接受的纯度、质量和产量水平，可以锁定这里所使用的工艺。 分析-在调节到下一步的上样条件和通过无菌过滤器过滤后，分析Protein A步骤样品的纯度和质量。此外，在2或3步基于平台工艺的层析步骤后，必须分析纯度和质量。如果上述导致洗脱组份中的低产量或高宿主细胞蛋白残留（HCP），则须优化清洗和洗脱条件完成进一步的工艺开发。 清洗条件-GE Healthcare已经完成了各种清洗条件的探索研究。为了了解更多关于这些研究的信息，请向您当地GE Healthcare公司的代表索取《讨论对于Protein A的中间清洗步骤》的科学海报（参考文献3）。 洗脱条件-可以考虑各种洗脱条件，例如柠檬酸缓冲液（10-100 mM）或甘氨酸。当优化洗脱条件用于更好的杂质**时，确定抗体有效解吸的高pH，然而，这可能会增加洗脱组份体积。另外，设计洗脱条件以匹配用于病毒灭活所需要的pH，如下面所讨论。 步骤持续时间-这里提到的所有的步骤持续时间只是象征性的，如果特定步骤中层析图和收集指示时间，可以缩短实际步骤的持续时间。 病毒灭活-洗脱组份中的pH应保持在3.6或更低至少持续30分钟，用于适当的病毒灭活。如果洗脱组份具有更高的pH，需要通过添加酸滴定或通过对洗脱缓冲液体积的进一步优化降低pH。然后通过加入0.1 M NaOH调节pH，pH必须马上被调整到匹配下一步上样条件。（例如对于阳离子交换为pH 5-6或对于Capto adhere为pH 6-8）。在洗脱期间可能会发生沉淀，且一般发生在pH滴定后低pH病毒灭活期间。有可能沉淀包含脂类和微量Mab、HCP和Protein A。这种沉淀物可以使用无菌过滤器去除-必须选择正确的过滤膜的孔径-尽管生产中通常使用的过滤膜孔径对于这一步已经足够大。 结论 推荐的工艺开发途径是采用HTPD和分析多个条件。本文件中的信息是基于以前的经验，并可以作为步骤开发的起点。为了获得步骤或工艺开发的进一步帮助，请联系您当地的GE Healthcare销售代表或GE Healthcare的Fast Trak部门。 注释： *应使用正确装柱方法-详情见参考文献2（压缩系数1.15）； ** 0.1 M醋酸将有大约2.9的pH，不具有缓冲能力。洗脱组份的结果pH将取决于洗脱组份体积和之前的洗涤缓冲液的缓冲能力。在大多数情况下，洗脱组份pH将在3.5-4.0之间； ***对于循环时间：假设物料浓度为2.5g/L，上样载量为35g/L。保存时间和保存后的平衡时间不计（~53分钟）。
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