定量原理 定量PCR可以实时检测PCR的全过程，为了准确定量和计算，取PCR反应的前半段指数扩增期数据。因为检测的是荧光信号，首先需设定一个域值(threshold)作为荧光本底信号(baseline)。从扩增曲线上可以看到，在初始的若干个循环，由于荧光信号变化弱而一直在本底基线附近波动。当检测到的荧光信号超过域值，就被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(Ct)——PCR扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。实验操作中，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 显然，CT值取决于域值。域值的量化定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。实验操作中，域值范围定义是从第3个循环起到CT值前3个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整(前2个循环荧光信号太弱，扣除背景后的校正信号往往波动比较大；而在CT值前3个循环大多数情况下荧光信号已经开始增强，超过了基线高度)。从图1的重复实验中可以直观地看到，随着PCR反应过程，荧光信号从基线经一个转折点进入指数期、线性期和终的平台期，尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。如果用不同浓度模版DNA作PCR，可以看出模版浓度越高，CT值越小。模版浓度每增加1倍，CT值减小1个循环。CT值与模板DNA的起始拷贝数成反比。这一结论可以从数学上严格证明。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 模板定量可分为相对定量和定量。定量指的是用已知量的标准品作标准曲线来推算未知的样本的量。质粒DNA常作为定量标准品的制备之用。标准品的量可根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来转换成其拷贝数来确定。相对定量指的是在样本中目标序列相对于另一参照样本的量的变化。即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n倍。可以通过标准曲线法或者比较CT法进行相对定量，前者和定量相似，后者运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到CT值来反应起始模板的量，一个循环（CT=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。但是此方法是以靶基因和内参照的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。 无论定量还是相对定量，在得到实验结果后，还要考虑数据之间的可比性问题。在实验操作中，取样都是以体积或重量为单位的，但是同样体积或重量的样本所来源的细胞数目并不一样，所以拷贝/μL或拷贝/ng的定量数据相互之间实际上并不可比。只有将这些数据归一到以拷贝/细胞或拷贝/基因组为单位后，才可进行严格意义上的比较。这种校正可以通过适当的参比来完成。参比一般选用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的，受环境因素影响较小，其定量结果代表了样本中所含细胞或基因组的数量。为了减少误差，目标基因和参比基因好在同一反应管内同时进行定量测定，所以这种对照称为阳性内对照(Internal Positive Control，IPC)。要进行IPC归一化校正，定量PCR仪必���具备多色检测能力，好是4色。否则，目标基因和参比基因只能分两管作定量，就不成其为“内”标了。 定量实验与定性实验大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立各种对照非常重要。这一点在实践中往往被轻视或忽视。定量实验，误差是不可避免的。设立重复实验，对数据进行统计处理，可以将误差降低到小。所以定量实验的每个样本至少要重复3次以上，严格的定量更应当重复6～8次，以满足小样本统计的要求。 如果作定量，则标准曲线需要在5个点以上。标准曲线使用的标准品是浓度已知的DNA样本，虽然可以自己制备，为标准化以及发表文章起见好购买商品化的标准品。标准曲线的反应条件应当与样本完全一致，以便准确定量。 华东生物器材网（ www.jp1718.com）是上海金鹏旗下网站。本网是专业的生化器材网站，集生产、制造、销售于 一体。是ISO9001：2000认证单位，是销售生化器材品种**，规模庞大的专业企业。 上海金鹏分析仪器有限公司 www.jp1718.com 电话： 61425398 36162366 手机： QQ:964122960,765695826，842727501，170324176 传真： 地址：上海市真陈路1398弄15号 邮编：200444