小量表达
1． 取单克隆菌落小养过夜
2． 大养 50ml ，至 OD600 达 0.4-0.6
3． 取 1ml 培养液， 13000rpm ， 1min 离心收集， 30ul 水溶，加入 30ul 2 × SDS loading buffer ，－ 20 保存
4． 加入 IPTG 至 1mM ，每隔 2hr 重复步骤 3
5． 配置相应的 SDS － PAGE 胶
6． 将样在沸水中煮 5min ，上样 10ul ， 60V 跑浓缩胶， 120V 跑分离胶。
7． 取胶，考马斯亮蓝染色 30min ，脱色液脱色过夜
大量表达
1． 前三步相同
2． 加入 IPTG 至 1mM ，培养 6hr
3． 4 ℃ ， 8000rpm ，离心 10min ，去上清
4． 用 10ml 1 × PBS 重悬沉淀，加入溶菌酶 10mg ， 25 ℃ ， 30min
5． 加入蛋白酶抑制剂 PMSF 至终浓度为 1mM
6． 冰上超生破碎， 200W ， 30S 超声， 30S 间隔， 30 个循环
7． 加入 TritonX － 100 ，至终浓度为 1 ％，室温混合 30min 以提高融合蛋白的可浓性
8． 4 ℃ ， 12000rpm ，离心 10min ，分别取上清，沉淀
9． 上清，沉淀同时跑电泳，观察蛋白是在上清还是沉淀中
包涵体中蛋白的纯化
1． 将离心收集的菌体用包涵体蛋白纯化缓冲液洗涤一次
2． 用 1/50 菌液的上述缓冲液悬浮菌体，按每 1ml 加入 1mg 溶菌酶，于 25 ℃ 水浴 30min
3． 加入 PMSF 至 1mM ， 800W 超生破碎菌 10min
4． 剪切菌体 DNA
5． 5000rpm ， 4 ℃ ， 10min 离心，去上清
6． 25ml 上述缓冲液洗涤沉淀 3 次
7． 用上述缓冲液悬浮至终浓度为 0.5mg/ml
8． 悬浮蛋白溶液装入透析袋，于 50 倍体积透析液 I 中透析， 4 ℃ ， 10hr
9． 换 100 倍体积透析液 II 进行透析， 4 ℃ ， 10hr
10． 换 100 倍体积透析液 III 进行透析， 4 ℃ ， 10hr
11． 换 100 倍体积透析液 IV 进行透析， 4 ℃ ， 10hr
12． 吸出透析后的蛋白，稍离心除去丝状不溶物，分光光度计测蛋白浓度
His6 标记蛋白过 NTA 柱纯化
1． 将 Ni ＋ NTA 填料从 4 ℃ 取出，与乙醇混匀，装上柱子
2． 以 10 倍柱体积的 H2O 过柱，洗去乙醇
3． 以 50ml binging buffer 过柱
4． 蛋白溶液于 4 ℃ ， 12000rpm 离心 10min ，取上清，用 bingding buffer 稀释至 5 倍
5． 蛋白稀释液过柱，可适当降低过柱速率，使蛋白与柱充分结合
6． 以 50ml washing buffer 过柱
7． 以 20ml elution buffer 过柱，用 Eppendorf 管接过柱溶液，每管测 A280 值，与未过柱前所测 A280 值比较
8． 每管进行 SDS-PAGE 鉴定蛋白丰度
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