1 前言
植物叶片叶绿素含量与光合速率、营养状况等密切相关, 实践上通常测定叶绿素含量以表征植物生长状况,也往往把叶色变化作为看苗诊断和肥水管理的重要指标。叶绿素含量测定方法主要有分光光度法和活体叶绿素仪法两大类, *近又发展了光声光谱法。其中,应用*为广泛的是分光光度法。用得较多的是由M ack inney提出经A rnon解释和推导的A rnon 法以及80年代初提出的乙醇提取法, 本试验提出另一种提取溶剂—— 丙酮2乙醇混合法提取叶绿素, 以常规的A rnon 法(提取溶剂为80%丙酮) 和乙醇提取法作对比, 就3 种提取液对测定植物叶片叶绿素含量的影响进行了研究比较,并提出了一种快速测定叶绿素含量的方法。
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂
紫外可见分光光度计,高速电动匀浆器,电子天平(浙江托普仪器有限公司)，叶绿素测量仪。
将珊瑚树嫩叶用双蒸水洗净, 吸水纸吸干表面水分, 作为试验材料。叶绿素提取溶剂为: 95% 丙酮2乙醇(用体积比为2∶1的丙酮2无水乙醇混合液配成95% 的水溶液, 下同)、95% 乙醇和80% 丙酮, 均为分析纯。
2. 2 实验方法
叶绿素的提取: 将材料去脉剪碎(约1—2mm 见方) , 随机取样, 准确称重取015g (**到0.1mg) ,放入50mL 比色管中, 分别加入上述三种提取液25mL; 另称0.5g 样品, 加6mL 双蒸水和少量CaCO3, 匀浆,定容至25mL , 过滤, 取2.25mL 滤液放入50mL 比色管中, 加23.75mL 丙酮2乙醇(2∶1) , 使之成为95%丙酮2乙醇匀桨提取液。比色管加塞放置于25℃生化培养箱内暗中提取叶绿素。每种提取方法重复3 次。
叶绿素提取液吸收光谱的测定: 用分光光度计在600—700nm 范围内对不同叶绿素提取液进行扫描,波长精度为0.2nm。
叶绿素含量测定: 分别以提取溶剂作空白, 测定叶绿素提取液吸光度A 645、A 663, 利用A rnon公式:
叶绿素a 浓度(mgöL ) : Ca= 12. 7A 663- 2. 69A 645;
叶绿素b 浓度(mgöL ) : Cb= 22. 9A 645- 4. 68A 663;
叶绿素总浓度(mgöL ) : Ca+ b= Ca+ Cb。
计算提取液中叶绿素浓度, 换算为每克鲜叶叶绿素含量(mgög 鲜重)。
3 结果与讨论
3. 1 叶绿素提取液的吸收光谱
4 种叶绿素提取液的吸收光谱在600—700nm 范围内基本相似(图1) , 说明4 种叶绿素提取液的光吸收性质基本相似,可以用A rnon 公式进行叶绿素含量的计算。
3. 2 不同提取溶剂对叶绿素提取总量的影响
不同提取溶剂对叶绿素提取总量有着明显的影响(表1) , 95% 丙酮2乙醇提取的叶绿素总量*高, 高于传统的80%丙酮提取法29.5% ,95% 乙醇提取的叶绿素总量亦比80% 丙酮法高9.5%。95%丙酮2乙醇提取叶片匀浆的叶绿素总量与提取叶片碎片的叶绿素总量没有显著差异。
3. 3 不同提取溶剂提取叶绿素的进程
不同提取溶剂提取叶绿素速度差异较大, 提取完全程度也不同(表1)。提取速度*快的是95%丙酮2乙醇, 叶绿素经过8h已经基本提取完全, 叶片碎片变白; 其次是95% 乙醇, 而80% 丙酮提取速度*慢, 后两者在24h内没有完全提取出叶绿素。从提取速度来看, 95% 丙酮2乙醇要优于95%乙醇和80% 丙酮。叶片匀浆后用95% 丙酮2乙醇在015h就已经提取完全, 大大加快了叶绿素提取速度。
3. 4 不同提取液中叶绿素的稳定性
用不同提取溶剂提取珊瑚树叶片叶绿素, 在25℃生化培养箱中暗中放置0、3、6 天后测定提取液中叶绿素含量,结果见表2。叶绿素提取液放置6 天后, 叶绿素a 下降了5.8% —11.9% , 叶绿素b下降了2.7% —7.4% ,叶绿素总量下降了4.9% —10.5%。这些都说明, 在这些提取液中, 叶绿素b比叶绿素a 稳定。叶绿素提取液中叶绿素a、叶绿素b的含量、稳定性与提取材料、提取液性质和提取液含水量有关。为了提高叶绿素提取液的稳定性,可通过降低提取液中的含水量来实现。但若所用的材料是干粉, 提取液中*好含有适量的水分,使叶绿素分子中亲水的基因易与蛋白质分离,利于叶绿素从类囊体膜中游离出来。有些学者曾采用比传统丙酮法含水量更低的丙酮提取液提取鲜叶叶绿素,效果较好。本试验结果表明, 叶绿素在不同提取液中稳定性的大小依次为: 95% 丙酮2乙醇> 95%乙醇>80%丙酮。
3. 5 精密度实验
95% 丙酮2乙醇提取效果好, 提取速度快, 具有较高的精密度(表3)。
4 结论
分光光度法测定植物叶片叶绿素含量, 由于所用提取溶剂不同, 测定结果差异显著。一种好的提取溶剂应该提取速度快,叶绿素得率高, 稳定性好, 测定结果精密度高, 吸收光谱与传统丙酮法一致, 能用A rnon 公式计算叶绿素含量。本试验结果表明,95% 丙酮2乙醇法具有上述特点, 是一种较好的叶绿素提取溶剂, 而传统的80% 丙酮法和95% 乙醇法提取叶绿素速度慢,提取不完全, 应慎用。叶片经匀浆后再用丙酮2乙醇提取, 叶绿素得率与叶片浸泡法相似, 但大大提高了提取速度,这对于快速测定大量样品叶绿素含量具有实际意义。