SCI论文润色-抑制消减杂交（SSH）操作方法
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抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术。
SSH （抑制消减杂交）是利用抑制性PCR 能选择性指数扩增不同丰度差异基因和cDNA 消减杂交建立起来的方法,运用了杂交二级动力学原理即高丰度序列退火时产生同源杂交的速度大于低丰度序列,使原本在丰度上有差异的DNA 序列的相对含量趋于一致。
然后利用抑制性PCR 链内退火优于链间退火的特点,使两端接上同一接头的非目的基因片段,后者具有反向重复序列,因而在退火时易形成发卡状互补结构,在PCR 中不能作为模板与引物配对扩增,从而达到选择性扩增目的基因而抑制非目的基因片段扩增的目的。消减杂交去除了实验组和对照组之间的同源序列,再结合抑制性PCR 的动力学富集,能高效地分离出丰度较低的特异性非同源片段
差减文库构建实验流程
选取材料
总RNA提取
mRNA的分离与纯化
cDNA的合成
RsaⅠ酶切
接头连接
**次扣除杂交
**次扣除杂交
**次抑制性PCR
**次抑制性PCR
PCR产物的纯化
PCR产物与载体的连接
载体的转化
克隆构建
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