基本信息
货号：15271
储存条件：保存在冰箱，避光
适用仪器：吸光板酶标仪
简介
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是在细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定基于监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化。 NAD / NADH和NADP / NADPH测定的短紫外波长使得传统方法具有低灵敏度和高干扰。 AAT Bioquest的Amplite™比色NADH检测试剂盒为检测NADH提供了一种便捷的方法。 NADH探针是一种生色传感器，在NADH减少时具有460nm的极大吸光度。 NADH探针的吸收与溶液中NADH的浓度成正比。 Amplite™比色NADH分析试剂盒提供灵敏的分析，可在100μL分析体积中检测低至3μM的NADH。
试剂盒组成
96孔板的检测分析
简要概括
准备NADH反应混合物（50μL）®
添加NADH标准品或测试样品（50μL）®
在室温下孵育15分钟至2小时®
监测460 nm处的吸光度
注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个
操作步骤
1.准备NADH储备溶液：
将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol /μL）NADH储备溶液。
注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.准备NADH反应混合物：
将1mL NADH探针（组分A）加入4mL NADH测定缓冲液（组分B）中，并充分混合。
注意：5mL NADH反应混合物用于一个96孔。未使用的NADH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADH标准品的连续稀释液（0至100μM）：
3.1将100μL的NADH储备液（来自步骤1）加入400μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，生成200μM（100 pmol / L）NADH标准溶液。注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
3.2取200μL的200μMNADH标准溶液进行1：2连续稀释，得到NADH标准品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM连续稀释液。
3.3如表1和2所述，将NADH标准品和含有NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。注意：根据需要制备细胞或组织样品。
表1白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局
表2每个孔的试剂组成
*注意：将连续稀释的NADH标准品（3.13μM至200μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。
4.在上清液反应中运行NADH测定：
4.1将50μL的NADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADH测定体积为100μL/孔
注1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。
注2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞（详见附录）。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
4.3使用吸光度读板仪在460 nm处监测吸光度的增加。
数据分析
空白孔中的吸光度（仅使用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。
图1。 使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices），使用Amplite™比色NADH分析试剂盒在96孔白色/透明底板中测量NADH剂量反应。孵育30分钟可检测到低至3μM的NADH（n = 3） 在460nm处测量吸光度。
附录：使用组分D（裂解缓冲液）的测试样品制剂
1.植物细胞样品：用200mg / mL的裂解缓冲液均质化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。
2.**细胞样品：离心收集**细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟，用上清液进行试验。
3.哺乳动物细胞样品：从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。
4.组织样品：称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。
参考文献
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