产品简介
胆固醇，是建立和维持细胞的必需品。它在生理温度范围内调节膜流动性。在细胞内，胆固醇是几种生化途径中的前体分子。胆固醇也是合成维生素D和类固醇**的重要前体分子，包括肾上腺**皮质醇和醛固酮以及性**黄体酮，雌**，睾酮及其衍生物。
Amplite™荧光胆固醇定量试剂盒是量化胆固醇*敏感的方法之一。该试剂盒使用Amplite™Red来定量胆固醇浓度，这与胆固醇氧化酶介导的酶偶联反应中胆固醇存在时过氧化氢的产生有关。胆固醇的量与酶偶联反应循环中形成的过氧化氢的浓度成比例。在存在过氧化物酶的情况下，Amplite TM Red的荧光强度与转化为胆固醇浓度的过氧化氢浓度成比例。可以用Ex / Em = ~540 / 590nm的荧光酶标仪容易地读取测定法。
试剂盒套件
96孔板实验方案
简要概述
1. 准备测定反应混合物（50μL）®
2. 添加胆固醇标准品或测试样品（50μL）®
3. 在室温或37°C培养30分钟®
4. 在Ex / Em = 540/590 nm处监测荧光增加
注意：在开始实验之前，将所有试剂盒组分解冻至室温。
操作步骤
1.准备Amplite™Red原液（250X）：
将40μLDMSO（组分E）加入Amplite™Red小瓶（组分A）中。应立即使用原液。 需要将任何剩余的溶液等分并在-20°C下重新冷冻。
注1：避免反复冻融循环。
注2：在硫醇如二硫苏糖醇（DTT）和2-巯基乙醇存在下，Amplite™Red不稳定。反应中DTT或2-巯基乙醇的*终浓度应不高于10μM。 Amplite™Red在高pH（> 8.5）下也不稳定。反应应在pH 7-8下进行。建议使用提供的pH 7.4的分析缓冲液。
2.准备连续稀释的胆固醇标准品（0至10μM）：
2.1将10μL2mM胆固醇标准品（组分D）加入990μL测定缓冲液（组分B）中，产生20μM胆固醇标准品。
2.2取300μL20μM胆固醇标准品进行1：3连续稀释，得到10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM系列稀释胆固醇标准品。
2.3如表1和2所述，将连续稀释的胆固醇标准品和/或含胆固醇的测试样品加入固体黑色96孔微量培养板中。
注：根据需要处理样品。
表1.固体黑色96孔微孔板中胆固醇标准品和测试样品的排布
注意：CHL =胆固醇标准品，BL =空白对照，TS =测试样品
表2.每个孔的试剂组成
注意：将连续稀释的胆固醇标准品从0到10μM添加到CHL1到CHL7的孔中，一式两份。
3.准备测定反应混合物：
3.1将5 mL测定缓冲液（组分B）加入胆固醇酶混合物（组分C）瓶中，并充分混合。
3.2将20μL的Amplite Red™原液（250X，来自步骤1）加入胆固醇酶混合瓶中（来自步骤3.1）。
4.运行胆固醇测定：
4.1将50μL测定反应混合物（来自步骤3.2）加入胆固醇标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤2.3，表1），使总胆固醇测定体积为100μL/孔。
注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL测定反应混合物。
4.2在室温或37°C培养反应30分钟，避光。
4.3使用荧光板读写器监测Ex / Em = 530-570nm / 590-600nm处的荧光增加（在Ex / Em = 540 / 590nm处*佳）。
注意：也可将板的内容物转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576×5nm波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。
数据分析
空白孔中的荧光（仅含测定缓冲液）用作对照，并从具有胆固醇反应的那些孔的值中减去。胆固醇标准曲线如图1所示。
注意：荧光背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值很重要。
