今天百萤生物带您了解一种可以检测晚期细胞凋亡中DNA片段的方法。随着科学的进步，人们发现多细胞生物由高度有组织的细胞群组成，而重要的是多细胞生物拥有复杂的细胞过程，如细胞增殖和细胞凋亡建立稳态。任何一个过程的不适当转变都会导致**。例如，神经元中细胞凋亡活性的增加是各种神经退行性**如阿尔茨海默氏病和帕金森病的根源。相反，细胞凋亡机制的丧失可导致过度的细胞生长，这是细胞如何变成癌症的潜在机制。总体而言，细胞凋亡在**中的作用是一项很热门的科学研究。
细胞凋亡是复杂且精心编排的程序性细胞死亡的途径。这种细胞自主过程的特征在于几种不同的形态学和生物化学标记，包括细胞和核收缩，染色质浓缩，细胞质膜起泡和核DNA片段化。这些形态变化都源于两种凋亡途径：外在或内在途径。外在途径是由细胞外死亡受体配体（例如肿瘤坏死因子（TNF）或Fas配体（FasL））激活的受体介导的途径。内源性途径由环境应激物在细胞内诱导，导致线粒体膜透化和凋亡诱导因子（AIF）和细胞色素c的释放。来自两种途径的信号通过caspase级联反应，*终导致caspase激活的蛋白酶下游消化DNA。细胞凋亡的这些特征允许使用DNA片段化测定法作为鉴定细胞凋亡的*终决定因素。
图1.概述了细胞凋亡中涉及的所有参数。这些事件的发生是无序的，它们中的许多将重叠并且经常同时发生。事件1至4是细胞凋亡的生物化学特征，其不一定以细胞死亡结束。下游细胞凋亡事件5至8是细胞已经致力于细胞凋亡的强有力指标，之后细胞不太可能存活。
1 膜不对称性丧失 5 G1细胞周期亚群增加
2 促凋亡Bcl-2蛋白的激活 6 核固缩
3 caspase激活 7 DNA片段化
4 线粒体膜电位的丧失和细胞色素c的释放 8 细胞膜破裂
检测DNA片段化的凋亡检测
有各种技术用于评估和鉴定凋亡DNA片段化。*早的测定是基于凝胶的DNA梯度测定，其涉及使用琼脂糖凝胶电泳来可视化和分离DNA片段。细胞凋亡的DNA片段化由一种独特的“梯状”模式表示，核小体片段的长度约为180-200个碱基对。尽管有效地生成定性数据，但该技术不易适应高吞吐量使用。
另一种检测方法采用双抗体夹心ELSIA试验，该试验由抗DNA和抗组蛋白抗体组成，以在凋亡过程中显现DNA片段化。尽管该测定法在检测凋亡DNA片段方面明显更敏感并且适合于高通量用途（例如化合物筛选），但是它是劳动密集型的并且抗体的使用是昂贵的。
TUNEL分析
1992年，Gorczyca等人。1992年引入了一种利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和切口平移或TUNEL测定法测量细胞凋亡DNA片段化的新方法。TdT催化荧光团标记的脱氧尿苷三磷酸（dUTP）加入到DNA双链断裂（DSB）的3'-羟基末端。
自引入TUNEL试验以来，它已成为一种广泛接受的原位技术，用于鉴定凋亡细胞死亡。与以前的方法相比，TUNEL分析更灵敏，能够在几个数量级上进行广泛的定量测量。多年来，TUNEL技术已针对生色和荧光检测方法进行了调整和优化。显色TUNEL测定利用与生物素缀合的dUTP和酶标记的链霉抗生物素蛋白进行高灵敏度染色。荧光检测方法依赖于荧光染料偶联的dUTP，其用于直接检测DNA片段化。
几个变量影响TUNEL测定的染色动力学。这些变量中的一些包括试剂浓度，样品固定和DNA链断裂的可及性，其可在组织或细胞样品类型之间变化。因此，标准化您选择的TUNEL检测并进行适当的控制对于数据收集和解释至关重要。
Cell Meter™TUNEL细胞凋亡检测
AAT Bioquest的Cell Meter™TUNEL细胞凋亡检测针对荧光检测进行了优化，可提供绿色或红色荧光发**色。AAT Bioquest的Cell Meter™Assays包括所有必需成分和强大的方案，用于检测和定量细胞中的凋亡DNA片段化。通过使用TdT将荧光染料修饰的脱氧尿苷5'-三磷酸核苷酸Tunnelyte TM Green或Tunnelyte TM Red催化掺入DNA的3'OH末端来实现测量凋亡DNA片段。然后可以通过流式细胞术定量标记的DNA片段或通过荧光显微镜直接观察。
图2.用诱导细胞凋亡的化学物质，星形孢菌素（SS）处理的HeLa细胞中TUNEL反应的荧光图像。与未处理的对照相比，用100nM或1μMSS处理HeLa细胞4小时。将细胞与反应混合物在37℃温育1小时。使用具有FITC滤光器组的荧光显微镜分析绿色荧光信号。荧光标记的DNA链断裂在SS处理的细胞中显示出强烈的荧光染色。
Tunnelyte™Green在497 nm处的峰值吸收非常适合配备488 nm氩离子激光器的仪器进行高效激发。使用氦氖激光器的仪器可有效激发Tunnelyte™Red在547 nm处的峰值吸收。对于发射滤光片选择，可分别使用FITC（530/30）或Cy5（660/40）滤光片读取Tunnelyte™Green或Tunnelyte™Red。由于Tunnelyte™核苷酸与蓝色光谱充分分离，因此DAPI，Hoechest或Nuclear Violet™LCS1等染色剂适用于多色荧光应用中的活细胞复染。
图3.Tunnelyte™Green的吸收和发射光谱。激发波长为488nm（蓝色激光线）。Tunnelyte™绿色读数带有发射滤光片FITC（绿色波段）。
图4：Tunnelyte™Red的吸收和发射光谱。激发波长为561 nm（绿色激光线）。使用发射滤光片Cy5（红色波段）读取Tunnelyte™红色。
我们的Cell Meter™TUNEL细胞凋亡检测与其他市售TUNEL检测相比具有明显的优势，因为我们的试剂盒在反应缓冲液中不含有二甲胂酸钠或钾。消除二甲胂酸钠具有双重益处。首先，处理起来要**得多。其次，它提供了更灵敏和准确的细胞凋亡检测。二甲胂酸钠是一种致癌的砷衍生物，通过摄入，吸入或皮肤接触而具有高毒性。
实验流程
用测试化合物制备细胞
用4％甲醛固定细胞
用37℃的反应混合物孵育1小时
洗涤并在Ex / Em = 550/590 nm处分析细胞
注意：在室温下解冻组分C，使用前将组分A和B保存在冰上。
相关产品
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Cell Meter™TUNEL凋亡检测试剂盒
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品牌
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货号
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特点
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Ex(nm)
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Em(nm)
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AAT
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22844
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红色荧光
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556
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579
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AAT
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22849
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绿色荧光
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497
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520
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AAT Bioquest的Cell Meter™TUNEL检测试剂盒为检测细胞凋亡DNA片段提供了一种简单，**且灵敏的方法。荧光核苷酸的直接掺入通过减少所需的孵育步骤数量来减少测定时间，这允许更快地标记片段化DNA。*后，我们的试剂不含二甲胂酸钠，这使得我们的TUNEL实验产生的废物更容易处理。
百萤生物（Biolite），是 AAT Bioquest 中国区域上等代理商，为国内提供 AAT 的原装产品及产品定制、技术服务，欢迎咨询、订购！