定量分析晚期细胞凋亡中DNA片段的直接方法

多细胞生物是由高度组织化的细胞群落组成的，为了这个细胞群落的茁壮成长，重要的是1.通过复杂的细胞过程，如细胞增殖和凋亡，2.建立稳态。这两个过程中任何一个过程的不适当转变都会导致**。例如，神经元凋亡活性的增加是各种神经退行性**如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症的根源。相反，凋亡机制的丧失会导致细胞过度生长，这是细胞癌变的潜在机制。总的来说，细胞凋亡在**中的作用是科学研究中的热门话题。

细胞凋亡

图1.概述了与细胞凋亡相关的所有参数。必须注意，这些事件不是按顺序发生的。它们中的许多将重叠，并且常常同时发生。事件1到4是凋亡的生化特征，不一定以细胞死亡结束。下游凋亡事件5到8是细胞发生凋亡的有力标志，此后细胞存活的可能性很小。

细胞凋亡是一种复杂的细胞程序性死亡途径。这种细胞自主活动过程的特点有几个不同的形态和生化标记，包括细胞和核收缩，染色质凝聚，细胞质膜泡和核DNA断裂。这些形态学变化都源于两种凋亡途径：外源性或内源性途径。外源性途径是由细胞外死亡受体配体（如肿瘤坏死因子（TNF）或Fas配体（FasL））激活的受体介导的途径。内源性途径是由环境应激引起的线粒体膜通透性和凋亡诱导因子（AIF）和细胞色素c的释放在细胞内诱导的。这两种途径的信号通过caspase级联传递，*终导致caspase激活的核酸酶对细胞核DNA的下游消化。细胞凋亡的这些特征使得DNA片段分析能够作为识别细胞凋亡的*终决定因素。

DNA片段的凋亡检测

目前有各种各样的技术可以用来来评估和鉴定凋亡DNA片段。*早的检测方法是凝胶的DNA阶梯分析法，使用琼脂糖凝胶电泳来可视化和分离DNA片段。凋亡的DNA片段是一个独特的“梯状”模式的核体片段约180-200碱基对的长度。虽然该技术在生成定性数据方面很有效，但不适应高通量的应用。

另一种检测方法是用抗DNA和抗组蛋白抗体组成的双抗体夹心ELSIA法来观察细胞凋亡过程中DNA的断裂。尽管这种检测方法在检测凋亡DNA片段方面更为敏感，并且易于高通量使用（例如复合筛选），但它需要长时间手动操作，并且抗体的使用比较昂贵。

TUNEL测定

1992年，Gorczyca等人引入了一种新的用于DNA片段凋亡检测的方法，该方法利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和切口平移或TUNEL测定法测量凋亡性DNA片段化。TdT催化将荧光团标记的脱氧尿苷三磷酸（dUTP）添加到DNA双链断裂（DSB）的3'-羟基末端。

自从引入TUNEL检测法以来，它已成为一种广泛认可的用于鉴定凋亡细胞死亡的原位技术。 与以前的方法相比，TUNEL测定具有更灵敏的能力，可以在几个数量级上进行广泛的定量测量。 多年来，TUNEL技术已经针对显色和荧光检测方法进行了调整和优化。 荧光TUNEL检测利用与生物素偶联的dUTP和酶标记的抗生蛋白链菌素进行高灵敏度染色。 荧光检测方法依赖于荧光染料偶联的dUTP，可直接检测DNA片段。

影响TUNEL染色的因素有许多。其中一些变量包括试剂浓度、样品固定和DNA链断裂后的末端连接等，这些可能因组织或细胞样品类型而异。

Cell Meter TUNEL细胞凋亡检测

AAT Bioquest的Cell Meter TUNEL细胞凋亡测定法针对荧光检测进行了优化，可用于绿色或红色荧光发射。 AAT Bioquest的Cell Meter 检测包括所有必需成分和实验方案，可以检测和定量细胞中凋亡的DNA片段。 通过使用TdT将荧光染料修饰的脱氧尿苷5'-三磷酸核苷酸（Tunnelyte Green或Tunnelyte Red）催化并入DNA的3'OH末端，来检测凋亡的DNA片段。 然后可以通过流式细胞仪定量标记的DNA片段，或通过荧光显微镜直接观察。

图2.用诱导凋亡的化学物质星形孢菌素（SS）处理HeLa细胞中TUNEL反应的荧光图像。 与未处理的对照相比，将HeLa细胞用100 nM或1μMSS处理4小时。 将细胞与反应混合物在37ºC下孵育1小时。 使用带有FITC滤光片组的荧光显微镜分析绿色荧光信号。 荧光标记的DNA链断裂在SS处理的细胞中表现出强烈的荧光。

Tunnelyte™绿色的497 nm峰值吸收非常适合通过配备488 nm氩离子激光线的仪器进行有效激发。对于发射滤波片的选择，可以分别使用FITC（530/30）或Cy5（660/40）滤波片读取Tunnelyte™绿色或Tunnelyte™红色。 由于Tunnelyte™核苷酸已与蓝色光谱充分分离，因此DAPI，Hoechst或Nuclear Violet LCS1等染色剂适用于多色荧光应用中的活细胞复染。

图3.左：Tunnelyte Green的吸收和发射光谱。 激发波长为488 nm（蓝色激发光线）。 带有发射滤光片FITC的Tunnelyte Green读数（绿色波段）。右：Tunnelyte Red的吸收和发射光谱。 激发波长为561 nm（绿色激发光线）。 带有发射滤光片Cy5的Tunnelyte Red读数（红色波段）。

我们的Cell Meter TUNEL细胞凋亡检测试剂盒比其他市售TUNEL检测试剂盒具有明显的优势，因为我们的试剂盒在反应缓冲液中不含二甲基胂酸钠或钾。 不含二甲基胂酸钠或钾有两个好处，首先，它要**得多。其次，它提供了更灵敏，准确的凋亡检测方法。二甲基胂酸钠是一种致癌的砷衍生物，由于摄入，吸入或皮肤接触而具有剧毒。由于毒性，它可以诱导细胞凋亡，在测定中测量细胞凋亡时不可避免地会导致细胞信号干扰。

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