简介
Calcein AM是一种疏水性化合物，可以很容易地渗透到完整的活细胞中。 它广泛用于细胞活力测定。 通过细胞内酯酶水解非荧光钙黄绿素AM产生强荧光的亲水钙黄绿素，其在细胞质中良好保留。 酯酶活性与活细胞数成正比，因此与荧光强度直接相关钙黄绿素产生自酯酶催化的钙黄绿素AM水解。 Calcein AM是用于标记和监测活细胞细胞功能的流行的荧光探针之一。 然而，Calcein AM的单色使得在多色应用中不可能使用这种有价值的试剂。 例如，由于钙黄绿素AM具有与GFP相同的颜色，因此不可能将钙黄绿素AM与GFP转染的细胞组合使用。
光谱特性
为了解决上述Calcein AM的颜色限制，我们开发了Calcein Orange™和Calcein Red™。 这两种新的Calcein AM类似物与Calcein AM结合使用，可以对活细胞进行多色标记和功能分析。 此外，我们还开发了CytoCalcein™Violet 450，CytoCalcein™Violet 500，CytoCalcein™Blue 550和CytoCalcein™Blue 600，用于流式细胞仪应用。 CytoCalcein™染料与Calcein具有相似的生物学特性，它们针对各种流式细胞仪的激发波长进行了优化，为活细胞的流式细胞分析提供了额外的颜色。 CytoCalcein™Violet 450和CytoCalcein™Violet 500被紫激光（405 nm）激发，并分别在450 nm和500 nm发出荧光。 CytoCalcein™Blue 550和CytoCalcein™Blue 550被蓝色激光（488 nm）激发，并分别在550 nm和600 nm处发出荧光。
表1.细胞活力检测试剂的光谱特性
使用细胞活力指标AM酯类
AM酯是非极性酯，其易于穿过活细胞膜，并且通过活细胞内的细胞酯酶快速水解。 AM酯广泛用于非侵入性地将各种极性荧光探针加载到活细胞中。 但是，使用AM酯时必须小心，因为它们易于水解，特别是在溶液中。 它们应在使用前重新配制上等无水二甲基亚砜（DMSO）。 DMSO储备溶液可以在-20℃下干燥储存并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定数月。
以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的方案。 该步骤仅提供指南，应根据您的特定需求进行修改。
a）在高质量无水DMSO中制备2至5mM AM酯的储备溶液。非离子的洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加AM酯的水溶性。
注意：可将等体积的20％Pluronic®F-127溶液添加到DMSO储备溶液中细胞活力指示剂在稀释到上样缓冲液之前。Pluronic®F-127
浓度约为0.02％。各种Pluronic®F-127解决方案可从AAT获取
注意：不建议在Pluronic®F-127存在下长期储存AM酯。
b）在实验当天，要么在DMSO中溶解细胞活力的固体指标，要么溶解细胞活力将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。准备一个有效的解决方案在您选择的缓冲液中1至10μM（如Hanks和Hepes缓冲液）。对于大多数细胞建议浓度范围为4至5μM的细胞活力指标。细胞加载所需指标的确切浓度必须根据经验确定。
c）如果您的细胞含有有机阴离子转运蛋白，丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮可以向细胞培养基中加入（0.1-0.25mM）以减少脱酯化指示剂的泄漏。在室温或37℃下将细胞与AM酯孵育20分钟至1小时。
注意：降低加载温度可能会降低指示器的划分。
d）在细胞活力指示剂缓冲液（含有阴离子转运蛋白抑制剂，如果适用）中洗涤细胞以除去过量的探针。
注意：通过流式细胞术立即分析细胞样品，以确定零时间的每个细胞的平均荧光而不洗涤。
e）在所需的Ex / Em波长下进行实验（见表1）。
储存条件：
储存于-20°C，避光。 到期日为自收到之日起6个月。
参考文献
1. Zibek S, Stett A, Koltay P, Hu M, Zengerle R, Nisch W, Stelzle M. (2006) Localized functional chemical stimulation of TE 671 cells cultured on nanoporous membrane by calcein and acetylcholine. Biophys J.
2. Klesius PH, Evans JJ, Shoemaker CA, Pasnik DJ. (2006) A vaccination and challenge model using calcein marked fish. Fish Shellfish Immunol, 20, 20.
3. Bratosin D, Mitrofan L, Palii C, Estaquier J, Montreuil J. (2005) Novel fluorescence assay using calcein-AM for the determination of human erythrocyte viability and aging. Cytometry A, 66, 78.
4. Schoonen WG, Westerink WM, de Roos JA, Debiton E. (2005) Cytotoxic effects of 100 reference compounds on Hep G2 and HeLa cells and of 60 compounds on ECC-1 and CHO cells. I mechanistic assays on ROS, glutathione depletion and calcein uptake. Toxicol In Vitro, 19, 505.
5. Uggeri J, Gatti R, Belletti S, Scandroglio R, Corradini R, Rotoli BM, Orlandini G. (2004) CalceinAM is a detector of intracellular oxidative activity. Histochem Cell Biol, 122, 499.
6. Mueller H, Kassack MU, Wiese M. (2004) Comparison of the usefulness of the MTT, ATP, and calcein assays to predict the potency of cytotoxic agents in various human cancer cell lines. J Biomol Screen, 9, 506.
7. Iwanowicz LR, Densmore CL, Ottinger CA. (2004) Calcein AM release-based cytotoxic cell assay for fish leucocytes. Fish Shellfish Immunol, 16, 127. 8. Tokudome Y, Sugibayashi K. (2003) The synergic effects of various electrolytes and electroporation on the in vitro skin permeation of calcein. J Control Release, 92, 93.