酶联免yi吸附试验（简称ELISA）概述
ELISA是一种基于平板的免yi测定法，用于检测和定量生物分子如抗体、蛋白质、激su或肽，以及蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用的角色塑造。在ELISA中，感兴趣的靶标(通常是抗原)被固定在固体表面上，然后用与酶(如辣根过氧化物酶蛋白(HRP)或碱性磷酸酶蛋白(AP))结合的抗体进行探测。定量是通过与底物孵育实现的，底物是由酶催化的，产生可测量的副产品。酶联免yi吸附法一般分为三类:直接ELISA、间接ELISA和三明治ELISA。
一.直接ELISA
在直接ELISA中,抗原通过被动吸附直接固定在平板表面,并用HRP标记的原抗体检测。将无色底物引入样品,样品与酶结合物反应,产生可测量的副产物。根据衬底的选择,这种副产品可以是比色的,化学发光的或荧光的。信号产生的数量与样品中抗原的数量成正比。在所有的酶联免yi吸附测定格式中,直接酶联免yi吸附测定是简单和快的,然而,它们是不敏感的。
比色直接ELISA
实验方法：
1. 用检测抗原、密封板和在4摄氏度下一夜培养的酶联免yi吸附试验板
2. 用所需缓冲剂拆下涂层溶液和清洗板2次
3. 在4摄氏度时,用所需封块溶液进行1小时的封块板
4. 用缓冲器洗盘子3次
5. 在室温下用HRP标记的原抗体注射1小时
6. 用缓冲器洗盘子4次
7. 带重复使用的长衬底溶液的嵌入板(CAT编号) 11012 在室温下持续15-30分钟。
8. 用酶联免yi吸附仪微平板探测器测量650纳米的吸收信号
二.间接ELISA
间接ELISA实质上是直接ELISA的修正版。在间接酶联免yi吸附法中,用于检测抗原的主要抗体是不结合的。取而代之的是一种酶标记的次级抗体,它对主抗体的寄种具有反应性,用于检测主抗原复合物(间接检测抗原)。将无色底物引入样品中,样品与酶结合物反应,产生可测量的副产物。根据底物的选择,这种副产物可以是比色的,化学发光的或荧光的。信号产生的数量与样品中抗原的数量成正比。二次检测试剂的使用优于直接酶联免yi吸附测定(即信号放大)。
比色法间接ELISA
试验方法：
1.用检测抗原、密封板和在4摄氏度下一夜培养的酶联免yi吸附试验板
2.用所需缓冲剂拆下涂层溶液和清洗板2次
3.在4摄氏度时,用所需封块溶液进行1小时的封块板
4.用缓冲器洗盘子2次
5.常温下未结合初级抗体植入1小时
6.用缓冲器洗盘子4次
7.用HRP标记的二次抗体在室温下植入1小时(阻断缓冲)
8.用缓冲器洗盘子4次
9.带重复使用的长衬底溶液的嵌入板(CAT编号) 11012 在室温下持续15-30分钟。
10.用酶联免yi吸附仪微平板探测器测量650纳米的吸收信号
三．三明治ELISA
它要求使用匹配的抗体,每个抗体是针对不同的无重叠抗原表位。其中一种抗体,称为捕捉抗体,首先被涂在一个多井微滴板的表面,以促进固定目标抗原。然后di二种抗体,称为检测抗体,结合到捕捉抗体-抗原复合物(因此术语"三明治",因为抗原是结合在匹配的抗体对之间)。添加了检测抗体(而不是捕捉抗体)的酶标记次级抗体结合物。一旦二次结合到检测抗体,酶标记次级抗体催化反应与其各自的底物产生可测量的信号。
比色三明治ELISA
试验方法：
1. 含有捕捉抗体、密封板和4摄氏度夜间孵化的pcv微滴板覆盖井
2. 用所需缓冲剂拆下涂层溶液和清洗板2次
3. 在4摄氏度时,用所需封块溶液进行1小时的封块板
4. 用所需的缓冲器洗盘子2次
5. 在每一口井中添加样品,在37℃条件下孵化2小时
6. 用所需的缓冲剂将样品和清洗板拆下2次
7. 常温下注射1小时非结合检测抗体
8. 用所需的缓冲器洗盘子4次
9. 用HRP标记的二次抗体在室温下植入1小时(阻断缓冲)
10. 用所需的缓冲器洗盘子4次
11. 带重复使用的长衬底溶液的嵌入板(CAT编号) 11012 在室温下持续15-30分钟。
12. 用酶联免yi吸附仪微平板探测器测量650纳米的吸收信号