百萤课堂之一种新的活细胞钙通量荧光钙指示剂

荧光钙Ca2+指示剂（例如Indo-1,Fura-2,Fluo-3和Fluo-4）通常用于监测包括HTS、荧光成像和流式细胞术在内的各种应用中的Ca2+应答。然而，这些染料需要有机阴离子转运蛋白抑制剂（例如丙磺舒）的存在，以防止许多细胞类型（例如CHO和Hela）的指示剂泄露。有机阴离子转运蛋白抑制剂对细胞有毒性，其中一些已知是某些GPCR（例如趋化因子受体）的抑制剂。由于这些原因，这些染料的用途是有限的。因此，我们开发了一种超亮无丙磺舒荧光钙指示剂------Calbryte^TM520AM.Calbryte^TM520AM具有细胞渗透性和非荧光性。一旦进入细胞，Calbryte^TM520AM通过脂酶被加工成Calbryte^TM520。当与Ca2+结合时，Calbryte^TM520产生非常明亮的荧光信号，具有非常高的信号与背景（S/B比率）。

Calbryte^TM520AM荧光钙指示剂原理

方法：

1. 将100µL/孔细胞接种于37℃培养箱中的96孔黑壁/透明底Costar板中过夜；

2. 将细胞与含有钙指示剂(5µg/mL)的100µL染料上样缓冲液在37℃温育30分钟至1小时；

3. 然后在有或没有感兴趣的化合物的情况下在 37°C 下再孵育 15 分钟；

4. 去除染料上样缓冲液并用200µLHHBS（洗涤条件）或留在孔中（无洗涤条件）；

5. 加入50µL/孔的钙通量刺激剂，并通过荧光显微镜 (Keyence)、FlexStation (Molecular Devices) 或流式细胞仪 (NovCell 3000) 监测钙通量。

结果：

1.使用丙磺舒诱导CHO-K1细胞钙通量的研究

ATP诱导CHO-K1细胞内源性P2Y应答。将含有2.5mM丙磺舒的PluronicF127缓冲液中的Calbryte^TM520AM或Fluo-4AM与细胞在37℃温育45分钟。10µMATP（终结果）图像由荧光显微镜使用FITC频道拍摄。

2. 不使用丙磺舒诱导CHO-K1细胞钙通量的研究

ATP诱导CHO-K1细胞内源性P2Y应答。将含有2.5mM丙磺舒的PluronicF127缓冲液中的Calbryte^TM520AM或Fluo-4AM与细胞在37℃温育45分钟。10µMATP（终结果）图像由荧光显微镜使用FITC频道拍摄。

3.RANTE诱导CHO-CCR5细胞钙通量的研究

将表达趋化因子受体5(CCR5)的CHO细胞与Calbryte^TM520AM或Fluo-4AM在不同的染料上样缓冲液中在37℃下孵育1小时，

A) HHBS，含有含有 Pluronic F127，不含丙磺舒。

B) HHBS 与 Pluronic F127 和 2.5 mM 丙磺舒。

C) HHBS，含有 Pluronic F127 Plus 缓冲液，不含丙磺舒。通过 FlexStation 添加 100 nM RANTES（终浓度）之前和之后监测细胞内 Ca2+100秒。

4.阿托品抑制CHO-M1细胞中的钙通量

将表达 M1 毒蕈碱受体的 CHO 细胞与 Calbryte™ 520 AM 或 Fluo-4 AM 在不同的上样缓冲液中在 37°C 下孵育 1 小时。A) HHBS，含有 Pluronic F127，不含丙磺舒。B) HHBS 与 Pluronic F127 和 2.5 mM 丙磺舒。C) HHBS，含有 Pluronic F127 Plus 缓冲液，不含丙���舒。将阿托品添加到细胞中并在 37°C 下再孵育 15 分钟。通过 FlexStation 添加 1 µM 卡巴胆碱（终浓度）之前和之后监测细胞内 Ca2+ 100秒。

5.刀豆蛋白A诱导Jurkat细胞CCE的研究

每孔悬浮 250K Jurkat 细胞于无钙 HHBS 缓冲液中，然后细胞在 37°C 下用 含有HHBS 和 Pluronic F127 Plus 的 Calbryte™ 520 AM 或 Fluo-4 AM 孵育 1 小时。再使用含或不含通道抑制剂辣椒素的 刀豆蛋白 A（终浓度3 µg/ml）与细胞在 37°C 下孵育 10 分钟。通过 FlexStation 在加入 5 mM CaCl2 前后监测电容性钙离子（Ca2+）的输入（CCE），持续 100 秒。

6.通过流式细胞术测定ATP诱导的钙通量

A

B

将 CHO-K1 细胞与 Calbryte™ 520 AM 或 Fluo-4 AM 一起在含有 Pluronic F127 和 2.5 mM 丙磺舒的 HHBS 中于 37°C 孵育 30 分钟。将细胞从孔中分离并用HHBS洗涤两次。在添加 ATP 之前和添加 ATP 之后随时间推移通过流式细胞仪获取基线。A)向细胞中添加 0 µM、1 µM 或 10 µM ATP。图表上的箭头表示添加 ATP 和实际分析之间的时间。B)荧光信号随时间的变化。时间0是ATP刺激时间，初始检测相对于刺激大约30秒。

结论：

1. Calbryte™ 520 AM 使用荧光显微镜、FlexStation 和流式细胞仪监测CHO-K1、CHO-M1、CHO-CCR5 和 Jurkat 细胞中的Ca2+通量,比Fluo-4 AM 产生更明亮的信号（增加 3-4 倍）和更高的 S/B 比率（增加 3-4 倍）；

2. 如果没有丙磺舒，Fluo-4 AM 无法检测 CHO 细胞中的 Ca 2+通量，但是 Calbryte™ 520 AM 仍能获得良好的细胞滞留率和 S/B 比值。

3. 在 Calbryte™ 520 AM 和 Fluo-4 AM 培养的细胞中， Ca2+通量刺激剂或抑制剂的EC50计算值相当。