Western 免Y印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的实验。在WB 实验中常会出现各种问题，而拖慢实验速度，使实验达不到理想的效果。今天百萤跟各位同学一起分享下 WB 实验中各种问题及问题建议。
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常见问题
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可能原因
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建议
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电泳条带成笑脸状
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胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高
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减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳
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电泳条带成皱眉状
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可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全
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调整装置
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拖尾
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样品溶解不好
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样品充分溶解混匀后上样
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纹理(纵向条纹)
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样品中含有不溶性颗粒
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样品充分搅拌混匀
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条带偏斜
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电极不平衡或者加样位置偏斜
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调整电极和加样
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条带两边扩散
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加样量过多
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适当减少上样量
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Marker 变黑色
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抗体和 Marker 蛋白反应
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在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样
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背景高
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膜封闭不够
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延长封闭时间，选择适宜的抗体稀释度
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一抗稀释度不适宜
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对抗体进行滴度测试，选择适宜的抗体稀释度
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一抗孵育的温度偏高
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建议 4℃ 结合过夜
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二抗浓度度过高
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降低二抗浓度
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二抗的非特异性背景
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增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）
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二抗孵育时间过久
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减少二抗孵育时间
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选择膜的问题
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硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低
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膜在实验过程中干过
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实验过程中要注意保持膜的湿润
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检测时曝光时间过长
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注意曝光时间的缩短
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洗膜不充分
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增加洗膜的时间和次数
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抗体和封闭蛋白有交叉反应
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检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应
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杂带较多
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目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带
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查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小
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目的蛋白有其他剪切本
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查阅文献或生物信息学分析可能性
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样品处理过程中目的蛋白发生降解
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裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行
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上样量过高，太敏感
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适当减少上样量
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一抗不纯
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纯化抗体
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一抗特异性不高
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重新选择或制备高特异性的抗体
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二抗的非特异性结合
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增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）
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一抗或二抗浓度偏高
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降低抗体浓度
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细胞传代较多，导致蛋白变异
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使用原代或传代少的细胞作对照
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蛋白条带位置
（大小）不对
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二聚体或多聚体存在
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增加蛋白质变性过程及强度
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翻译后剪切
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比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式
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相对电荷
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氨基酸电荷的组成
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蛋白修饰
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比如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加
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胶浓度
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不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差
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无蛋白条带
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抗体孵育不充分
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增加抗体浓度，延长孵育时间
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酶失活
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直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
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标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低
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设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因
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试剂之间不匹配
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一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性
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一抗失效
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选择在有效期内抗体，幷选择现配现用的工作液
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HRP 抑制剂
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所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠
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抗体不能识别测试种属的相关蛋白
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购买抗体前应认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白
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二抗与一抗不匹配
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选择针对一抗来源种属的抗体
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蛋白条带信号弱
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抗体孵育不充分
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增加抗体浓度，延长孵育时间
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酶活性降低
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直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
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洗膜过度
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洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1% 的弱去垢剂 Tween-20
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标本中靶蛋白含量太低
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增加样本上样量
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抗体活性降低
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选择有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置
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蛋白转移不充分
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可以用丽春红染膜幷结合染胶（考马斯蓝）后确定条带是否转移到膜上或转移过度，适当调整转膜的时间和电流
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封闭过度
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减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型
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曝光时间过短
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延长曝光时间
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HRP 抑制剂
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所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠
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背景有黑色斑点
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抗体与封闭试剂反应
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使用前过滤封闭试剂
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HRP 偶联二抗中有聚集体
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过滤二抗试剂，去除聚集体
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暗背景上白色带
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HRP 含量过高
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降低酶联二抗的浓度
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背景有不均匀的白色斑点
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转膜过程中有气泡存在
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仔细检测，避免存在气泡
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抗体分布不均匀
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孵育抗体时使用摇床
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