注： PE 和 APC 的完整操作步骤及标记方案在后两页，如果不需要看介绍，可直接跳过
藻 红 蛋 白 (R-PE 及 B-PE)
特 点 ：
1.从红藻中纯化
2.具有极高的发射量子产率
3.荧光团与蛋白质主链共价结合，不被淬灭
4.高水溶性
R-PE 与 B-PE 的 区 别 ：
Wavelength (nm)
Wavelerngn (mm)
R-PE 与 B-PE 的 对 比 ：
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R-PE
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B-PE
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分子量
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240,000
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240,000
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*大吸收
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565 nm
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545 nm
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额外的吸收峰
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498 nm
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564nm
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*大发射
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573 nm
|
573 nm
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消光系数(ε)
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1.96x106 M-1cm-1
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2.41x106 M-1cm-1
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荧光量子产率(QY)
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0.84
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0.98
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吸收比
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A566/A280≥5.0
A566/A498<1.5
A620/A566<0.01
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A545/A280≥5.5
A565/A496<2.7
A620/A545<0.01
|
特 点 ：
1.从蓝藻中纯化
2.具有极高的发射量子产率
3.荧光团与蛋白质主链共价结合，不被淬灭
4.高水溶性
APC 和 C-PC 的区别：
APC 和 C-PC 的对比：
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APC
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C-PC
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分子量
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104,000
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264,000
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*大吸收
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651nm
|
651nm
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*大发射
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662nm
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647 nm
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消光系数(ɛ)
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7.3x105 M-1cm-1
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1.53x106cm-1M-1
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荧光量子产率(QY)
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0.68
|
0.81
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吸收比
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A650/A620≥1.25
A650/A280≥4.5
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A652/A620<0.3
A620/A280>4
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交 联 APC 和 APC 的 对 比 ：
1.APC 结构： 它具有α和β亚基，具有明显的(αβ)3 四级结构。
2.为什么要将APC 进 行 交 联 ?
答 ：交联是为了防止APC 在稀释或暴露于变性盐(如尿素或盐酸胍) 时
发生可逆解离，从而保持其结构和功能稳定。
3. 如何进行 APC 交联?
答：通过α和β亚基间的特异性 j联可以阻止APC 的分解。
交联比：>1.0
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NaClO4
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A650:A620
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CL-APC
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1.465849387
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CL-APC+NaClO4
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+
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1.386850153/
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|
|
NaClO4
|
A650:A620
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|
APC
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1.587272727
|
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APC+NaClO4
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+
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0.317901235
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注：图中的红色线条为没有添加NaClO4, 蓝色线条为添加了NaClO4。
如图及表中信息所示， CL-APC 图中添加NaClO4 及没添加NaClO4, 吸收比没有明显变化。而在未交联的APC
中， 添加NaClO4, 得到的吸收比有非常大的变化， 因为APC中加入了NaClO4 导致了它出现了解离。
特 点 ：
1.存在于大多数光合作用的甲藻中
2.高水溶性
3.大斯托克斯位移
光 谱 特 性 ：
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PerCP
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分子量
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35,000
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*大吸收
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483nm
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*大发射
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676nm
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消光系数(ε)
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4.0x105 M-1cm-1
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荧光量子产率(QY)
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1.0
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亮度(exQY)
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4.9x105M-1cm-1
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吸收比
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A482/A280>4.0
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一 .P E 的 制 备
1.将 PE 纯化。缀合前的浓度通常为 5-10 mg/ml 。 注意： PE 在缀合前作为 SAS ( 硫 酸 铵 钠 ) 沉
淀物*稳定。如果将 PE 以 SAS 沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。
2.使用3 .5毫克R-PE 修饰每毫克lgG, 包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。
3. 检查 PE 的纯度和浓度，请测量280、565 和 6 2 0 nm 处的吸光度。 (1 mg/ml 的 PE 在 565nm 处的 OD 为 8 . 2 ) 。 5 6 5 / 6 2 0 比 率 > 5 0 表示已充分去除污染的藻蓝蛋白；565/280 比 率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白质。
二 .P E 的 活 化
1.使用前在无水 DMSO 中制备 10 mg/ml 的 SMCC 储备溶液。
2.每毫克 PE 加 入 1 1 μlSMCC, 并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60 分钟。
3.将纯化的 PE 过凝胶过滤柱来交换缓冲液。
注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少 SMCC 相对于 PE 的量，可能会有所好转。
三 . 1gG 还 原
1.在蒸馏水中制备 1 M DTT(15.4 mg/100 μl) 的新鲜溶液。
2.1gG 溶液浓度应为 4 mg/ml 或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行； MES 、 磷酸盐和 TRIS 缓冲液 (pH 范围为 6 至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于 2 mg/ml, 则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。
3.用 DTT 配制 20 mMlgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并搅拌。室温下静置30
分钟，无需额外搅拌 (以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸)。
4.将还原的lgG 通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含
有大部分lgG 的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。
5.此步骤后尽快进行缀合。
注意：对于结合较差或失败的情况，降低 DTT 浓度可能会有所帮助。
四 .进 行 缀 合
1.每毫克 IgG 添 加 3.2 毫克 SMCC-PE。 用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60 分钟。注意：这些
摩 尔 比 ( 每 IgG 约 2 个 PE) 效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮 助。
2.60 分钟后，必须去掉 lgG 上未反应的游离巯基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制备 10 mg NEM 的新鲜溶液。
4.每 毫 克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室温下包裹并旋转20 分钟。
2.60 分钟后，必须去掉 lgG 上未反应的游离巯基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制备 10 mg NEM 的新鲜溶液。
4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室温下包裹并旋转20 分钟。
注1:整个缀合过程可以在 **内完成。但是，缀合前对APC 的纯化可能需要24-48小时。除了下面
列出的材料外，您还需要浓度至少为 2 mg/ml 的抗体溶液。请您在进行APC 抗体缀合实验之前熟悉
如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。
注 2 : SMCC-APC 缀合物非常稳定(在“交换缓冲液”中，在4C 下至少可以稳定几个月)。因此， 如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10 毫克或更多的 APC, 并将其用于几次抗体实验(
在几周内)。 SMCC-APC 的长期储存*好是作为饱和硫酸铵沉淀物。
一 .A PC 的 制 备
1.将 APC 纯化。缀合前的浓度通常为 5-10 mg/ml 。 注意： APC 在缀合前作为 SAS (硫酸铵钠)
沉淀物*稳定。如果将 APC 以 SAS 沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。在用每毫 升 1 升的“透析缓冲液”透析之前，用每毫升1 升 APC 的 PBS 进行透析2 次。
2.使用1 .7毫克APC 修饰每毫克lgG, 包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。
3.检查 APC 的纯度和浓度，请测量280、620和655 nm 处的吸光度。 (1 mg/ml 的 APC 在 655nm 处的 OD 为 5 . 9 ) 。 655/620 比 率 > 1 . 4 表明杂质被充分去除； 655/280 比 率 > 4 表 明所有其他蛋白质均已充分去除
二 .A PC 的 活 化
1.使用前在无水 DMSO 中制备 10 mg/ml 的 SMCC 储备溶液。
2.每毫克 APC 加 入 6 μlSMCC, 并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60 分钟。
3.将纯化的 APC 过凝胶过滤柱来交换缓冲液。
注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少 SMCC 相对于 APC 的量，可能会有所好转。
三 . 1gG 还 原
1.在蒸馏水中制备 1 M DTT(15.4 mg/100 μl) 的新鲜溶液。
2.1gG 溶液浓度应为 4 mg/ml 或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行； MES 、 磷酸盐和 TRIS 缓冲液 (pH 范围为 6 至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于 2 mg/ml, 则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。
3.用 DTT 配制 20 mMlgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并搅拌。室温下静置30
分钟，无需额外搅拌 (以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸)。
4.将还原的lgG 通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含
有大部分lgG 的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。
5.此步骤后尽快进行缀合。
注意：对于结合较差或失败的情况，降低 DTT 浓度可能会有所帮助。
四 .进 行 缀 合
1.每毫克IgG 添加 1 . 5毫克 SMCC-APC 。 用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60 分钟。注意：这 些 摩 尔 比 ( 每 1gG 约 2 个 APC) 效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所 帮助。
2.60 分钟后，必须去掉 lgG 上未反应的游离巯基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制备 10 mg NEM 的新鲜溶液。
4.每 毫 克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室温下包裹并旋转20 分钟。
1.
2.60 分钟后，必须去掉 lgG 上未反应的游离巯基。
3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制备 10 mg NEM 的新鲜溶液。
4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室温下包裹并旋转20 分钟。