百萤 活性氧 MiteROS 线粒体ROS 580概述
MitoROS 线粒体活性氧荧光探针580是用于检测线粒体活性氧的荧光探针，活性氧（ROS）是含氧的化学反应性分子。实例包括超氧化物，羟基，单线态氧和过氧化物。由于存在不成对的价电子，ROS具有高反应性。ROS形成氧的正常代谢的天然副产物，并且在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用。然而，在环境压力（例如，UV或热暴露）期间，ROS水平可显着增加。这可能导致细胞结构的显着损害。累积地，这被称为氧化应激。MitoROS 580是一种超氧化物敏感染料，在加载到活细胞后定位于线粒体。超氧化物氧化MitoROS 580会产生红色荧光。MitoROS 580可用荧光显微镜或荧光流式细胞仪监测线粒体中的超氧化物。MitoROS 580试剂渗透活细胞，选择性地靶向线粒体。它被超氧化物迅速氧化。它不太可能被其他活性氧（ROS）和活性氮物质（RNS）氧化。氧化产物在细胞中高度荧光。MitoROS 580为研究各种病理中的氧化应激提供了有价值的工具。
百萤 活性氧 MiteROS 线粒体ROS 580实验方案体ROS 580实验方案
使用MitoROS580分析方案
该协议仅提供指南，应根据您的具体需求进行修改。在制作MitoROS 580工作溶液之前，根据需要处理细胞。
溶液配制
1）MitoROS 580 原液 (1000X)配制
将 13 µL DMSO 添加到 MitoROS 580 小瓶中并充分混合。注意：未使用的原液可以储存在 -20 oC，避光保存。
2）MitoROS 580 工作溶液（2X）配制
用 20 mM Hepes 缓冲液 (HHBS) 将 DMSO 原液稀释到 Hanks 溶液中，制成 2X 工作溶液。注意：2X MitoROS 580 工作液不稳定，请及时使用。
操作步骤
1.细胞培养
2.将细胞（例如 96 孔板中的 100 µL/孔）与等体积的 2X MitoROS 580 工作溶液在 37°C 下孵育 10-30 分钟，避光。注意：MitoROS 580 的终细胞浓度不应超过 1 X。浓度超过 1 X 会产生细胞毒性效应，包括线粒体形态改变和荧光重新分布到细胞核和细胞质中。注意：不同细胞对 MitoROS 580 的反应不同，请相应调整工作浓度。
3.轻轻清洗细胞 3 次，并用 HHBS 缓冲液替换。
4.使用适当的荧光仪器 (例如, 荧光显微镜、流式细胞仪) 观察细胞。（Ex/Em = 510/580 nm）
图1.MitoRO 580(10µM)对不同活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的荧光响应。在Ex/Em = 540/590 nm处监测荧光强度
图2.使用 MitoROS 580 检测 Jurkat 细胞内的超氧化物。对于 AMA 处理（红色），将细胞在 37°C 下用 50 µM 抗霉素 A (AMA) 处理 30 分钟，然后与 MitoROS 580 一起孵育 1 小时。对于对照（蓝色），将细胞在 37°C 下与 MitoROS 580 一起孵育 1 小时，无需事先进行 AMA 处理。使用 BD FACSCalibur 流式细胞仪的 FL2 通道监测荧光信号。
图3.使用 MitoROS 580 对 HeLa 细胞中的超氧化物进行荧光成像测量。HeLa 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种在 100 µL 中，并在具有黑色壁和透明底部的 96 孔板中孵育过夜。对于 AMA 处理组，在 37°C 下用 50 µM 抗霉素 A (AMA) 处理细胞 30 分钟，然后用 MitoROS 580 孵育 1 小时。在未处理的对照组中，在 37°C 下用 MitoROS 580 孵育细胞 1 小时，无需任何先前的 AMA 处理。使用带有 TRITC 滤光片的荧光显微镜测量荧光信号。
图4.使用 MitoROS 580 检测 HeLa 细胞中的细胞内超氧化物。HeLa 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种在 100 µL 培养基中，并在具有黑色壁和透明底部的 96 孔板中孵育过夜。第 二天，用 50 µM 绿脓菌素 (Pyo)、50 µM 抗霉素 A (AMA) 处理细胞，或不处理作为对照。这些处理在 37°C 下进行 30 分钟。随后，将细胞在 37°C 下与 MitoROS 580 一起孵育 1 小时。使用 CLARIOstar 微孔板读数仪 (BMG Labtech) 测量荧光信号，激发/发射波长为 540/590 nm，截止波长为 570 nm，使用底部读取模式。