样品实验方案
简要概述
1.平板细胞并根据需要处理细胞
2.加入10μL/孔2-DG并在37℃下孵育20-40分钟
3.洗涤细胞并裂解细胞
4.加入50μl/孔的2-DG Uptake Assay工作溶液
5.在室温下孵育30至120分钟
6.监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光增加
溶液配制
1.储备溶液配制
除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
KRPH缓冲液原液（1X）：
将20mL KRPH缓冲液（5X）（组分H）加入到80mL去离子水中并充分混合。 注意：对于大约一个96孔板，50 mL体积的1×KRPH缓冲液就足够了。 按比例准备所需的音量。 将未使用的1×KRPH存放在4ºC或-20ºC。
2.工作溶液配制
1. NADP工作溶液：
将100μLH2O加入到NADP（组分G）的小瓶中并充分混合。
2.酶探针工作溶液：
将5mL测定缓冲液（组分F）加入酶探针瓶（组分E）中并充分混合。
3. 2-DG摄取分析工作溶液：
将100μL的NADP工作溶液加入酶探针工作溶液中并充分混合。 注意：这些数量适用于一个96孔板。
操作步骤
重要提示：该方案可用作培养3T3-L1脂肪细胞用于2-DG摄取的指导。
1.在生长培养基中以50,000-80,000细胞/孔/100μL/ 96孔或12,500-20,000细胞/孔/25μL/ 384-孔黑壁/透明底细胞培养Poly-D赖氨酸平板培养4-6小时。
2.从培养箱中取出细胞板，从孔中吸出培养基，用100μl/孔（96孔板）或25μl/孔（384孔板）无血清培养基除去细胞。将细胞在37ºC，5％CO2培养箱中孵育6小时至过夜。
3.从培养箱中取出细胞板，从孔中吸出培养基，用100μL/孔1×KRPH缓冲液轻轻洗涤细胞两次。
4.加入90μL/孔葡萄糖摄取缓冲液（组分B）并在37℃，5％CO2培养箱中孵育细胞1小时。
5.用或不用胰岛素或试验化合物刺激20分钟。加入10μL/孔的10×胰岛素溶液至终浓度为1μM或10×化合物测试溶液。并且还向未处理的孔中加入10μL胰岛素载体缓冲液或复合载体缓冲液作为对照，并在37℃，5％CO2培养箱中孵育20分钟。
6.对于葡萄糖摄取抑制研究，加入10×Phloretin至终浓度为200 uM或测试抑制剂，并在37ºC，5％CO2下孵育2-5分钟。注意：建议将10mL抑制剂载体缓冲液加入胰岛素处理和未处理的孔中作为对照。 Phloretin处理的细胞可用作阳性对照。
7.向每个孔中加入10μL/孔2-DG溶液（组分A），并在37℃，5％CO2培养箱中孵育20-40分钟。对于阴性对照，留下一些未经胰岛素，抑制剂和2-DG处理的孔。
8.处理后，取出每孔中的溶液，用KRPH缓冲液轻轻洗涤细胞3次，100μL/孔，从溶液中除去额外的2-DG。从孔中移除KRPH缓冲液。
9.向每个孔中加入25μL/孔酸性裂解缓冲液（组分C），并在37℃下孵育20分钟以裂解细胞。并且可以同时制备2DG摄取测定混合物。
10.向每个孔中加入25μL/孔中和缓冲液（组分D），充分混合，在室温下放置5-10分钟以中和细胞裂解物。
11.向2DG6P标准品或细胞裂解液的每个孔中加入50μL2DGUptake Assay工作溶液。
12.在室温下孵育反应30分钟至2小时，避光。
13.用Ex / Em = 530-570 / 590-600nm的荧光板读数器监测荧光增加（Ex / Em = 540 / 590nm，在570nm处截止）。