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武汉华联科生物技术有限公司
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蛋白质组学:**共沉淀实验技术(IP) 实验技术服务
实验技术原理: IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及**蛋白质的“prorein A"特异性地结合到**球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
实验操作流程:
1.样品准备:
1) 取细胞加入500μl上样Buffer(无溴酚蓝)和50ul 10mg/ml PMSF,混匀,超声波破碎细胞
2) 4℃,12000rpm离心10min
3) 取上清夜,-70℃冻存24hr
5) 4℃ 12000rpm再次离心10min,取上清分装,一份用于定蛋白,另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min,后于-20℃保存待用。
2.定蛋白及计算电泳上样量: 根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量,电泳上样量定为40ug
3.**沉淀:
1) 准备A蛋白-Sepharose珠:用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠
2) 准备A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物:按每50 μl A蛋白-Sepharose珠中加入10ul 一抗,4℃孵育1 h,8000rpm离心5 min,PBS洗涤3次,加50ulPBS
3) 取100 μg总蛋白,加入50ul A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物,4℃轻摇2h,PBS洗涤3次,之后加入50ul 1×SDS凝胶上样缓冲液,100℃变性3 min,以游离抗原、抗体、珠子,8000 rpm室温离心5 min,蛋白上清储于-20℃备用。
4.电泳:
1) 安装好电泳装置
2) 根据不同的指标配制相应浓度的分离胶,灌胶约3/5体积,液封 (<10%用0.1%SDS,>10%用异丙醇)
3) 30min后,待凝后倾去封液
4) 配5%的浓缩胶,灌胶至距平板顶部2mm处,插入梳子, 30min后,待凝后拔出梳子,用去离子水清洗加样孔,用滤纸吸干
5) 上样:各样品取50ug上样,marker取10μl上样(上样前需按说明书进行预处理)
6) 缓慢加入内、外槽缓冲液,接通电源,90v电泳至指示剂进入分离胶后,调电压至150V继续电泳
7) 当指示剂距平板底端1cm处时停止电泳
5.转膜及检测:
1) 准备2个Φ12cm的平面皿,一个装去离子水浸泡NC膜 20min,另一装转移缓冲液浸泡海绵和滤纸20min
2) 取下胶,切除浓缩胶部分后,将分离胶浸入转移缓冲液中约 5min
3) 按顺序安装好转膜装置(黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维膜-三层滤纸-海绵-红色板)
4) 完全排除气泡, 4℃,100mA转膜2hr。
5) 倾去转膜缓冲液,拆除转膜装置,将硝酸纤维膜放入丽春红中摇床染色15min,用去离子水清洗至能看到条带,后用铅笔标出marker位置,再用去离子水震荡以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右
6) 将膜转移至另一容器中,用5%脱脂奶粉封闭, 4℃过夜
7) 将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的一抗
8) 37℃摇床孵育约2hr
9) PBST洗涤4次,每次5min
10) 将膜转移至尽可能小的容器中并加入稀释好的二抗,37℃摇床孵育约30min
11) PBST洗涤4次,每次5min
12) 将膜转移至尽可能小的容器中并加入预先配制好的化学发光底物(A液与B液等体积混和),室温孵育5min后
13) 取出NC膜,去尽残液,包好,放入X-光片夹中显影
14) 扫描及分析
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