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武汉华联科生物技术有限公司
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**组化染色的假阴性及其对策
(二)**组化染色的假阴性及其对策
通常可因标本抗原保存,试剂质量及染色操作等因素引起假阴性。
1 、 组织处理不当 固定不及时或固定时间过长常导致抗原丢失。浸蜡温度过高,时间过长将破坏抗原的抗原性。应改善技术条件,重新取材。
2 、 抗原修复 由于目前所进行的常规石蜡切片标本均用甲醛固定,所形成的醛健、羧甲键等封闭了部分抗原决定簇,或由于蛋白之间发交联而使抗原决定簇隐蔽,因此在染色时,有些抗原需要先进行抗原修复或暴露。至于哪种抗原需要进行修复,需在建立染色程序时经实验确定。抗原修复分为化学方法和物理 / 化学方法。
( 1 )化学方法:主要是通过一些酶的作用,使抗原决定簇暴露。常用的酶有:胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等。需根据需要使用。
( 2 )物理 / 化学方法:主要有以下几种
① 单纯加热方法:将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的容器中,加热至沸腾,并持续 10~15 分钟,此方法操作简单、经济,适用于所有实验室,但对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。
② 高压加热方法:将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的高压锅中,加热至喷气,并持续 1~2 分钟。
③ 微波方法:将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的容器中,置微波炉加热至 95 ℃以上,并持续 10~15 分钟,室温 20~30 分钟自然晾凉,使蛋白复性。此方法不仅利用热效应,且可通过微波的直接作用,打开蛋白之间的交联键,将已被封闭的抗原决定簇暴露和修复。
3 、 一抗的选用、稀释度及孵育时间 **抗体是**组化染色中*重要的试剂。应用何种一抗,应根据具体目的和要求决定。临床病原诊断,要求较高的敏感性和较广的识别谱时,可选用多克隆抗体或几株混合的单克隆抗体,来避免抗体反应谱过窄造成的假阴性。某些研究工作需要检测单一抗原决定簇的存在,此时必须选用单克隆抗体。一抗的参考稀释度常由 “方格滴定”和相关检测结果推测得出,但因实验条件不同,对抗原活性的影响不同,*佳稀释度仍需经过摸索。任何一个抗体,其工作稀释度取决于如下因素:
( 1 )抗体的滴度即特异性抗体浓度;
( 2 )抗体的纯度,即抗体中杂蛋白的浓度。杂蛋白较高时,需要较高的稀释度;
( 3 )孵育的时间,时间越长,所用的抗体稀释倍数越高;
**组化
( 4 )组织中抗原含量对抗体的应用浓度有不同的要求。在**反应中,过多的抗体将导致阴性结果,这种现象类似于凝集反应中的前带现象。因此需用“方格滴定”的方法找出适当的稀释度,并得到*大强度的抗原染色和*低的背景着色。一般认为,某一稀释度下特异性染色较强且无背景着色,是较理想的稀释度,加长孵育时间可有效地降低所用抗体的浓度,有利于提高染色质量,节省抗体,可用 37 ℃ 0.5h 或 4 ℃过夜的方法。只要控制好温度、抗体稀释度和孵育时间,一般都能得到理想的染色效果。
4 、
**组化
选择适宜的二抗 二抗应用中常出现的总是是抗体本身与一抗不匹配,如抗兔的二抗,匹配鼠来源的一抗;或以抗鼠的二抗匹配兔来源的一抗,都会出现假阴性结果。
5 、 试剂造成的影响 酶的活性降低,缓冲液内加有叠氮钠抑制了酶活性,底物中所加 H 2O2 量少或失效,操作中漏加了某种试剂等,都会造成假阴性结果。如阳性对照不成立,则需认真检查操作程序,查找可能的原因。
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