Q: 用流式作细胞凋亡为什么跟tunel差别那么大啊? tunel测出来的细胞凋亡率大概有30%而作流式测出来的凋亡率只有2%(阴性对照0.5%)差别好大啊,用的是beckman公司的Annexin V /PI双染试剂盒,实验步骤如下:
(1)胰酶消化贴壁细胞,加培养基中止,离心1000转5min
(2)吸去上清,PBS0.5ml 重悬细胞(因为要送到别处作流式,期间路程约1h,户外温度约37度)
(3)然后加入Annexin V /PI各5微升,避光20min,上机。
请问这是什么原因导致的?
A: 两种方法测的凋亡率差别有点大,但还没有大到你这样的程度。双染测的是凋亡的早期事件PS外翻。TUNEL测的是凋亡*晚期的事件DNA片段化。而且TUNEL在检测过程中,把操作损伤细胞和坏死细胞当作了凋亡细胞,而且如果TUNEL是肉眼计数的话,也会有判断上的误差,所以,往往TUNEL作出来的凋亡率高一点。 但如果凋亡率达到30%,ladder估计也应该跑的出来。双染虽然是机器操作,但在调试补偿时,人为的影响还是挺明显的,也不是特别的客观。基线稍微左移,你的凋亡率就成倍上升。所以,给你的建议是在经费、时间允许的范围内再多做几次吧。感觉这么大的差异,可能这两种方法都会存在问题。还有,去流式的路上,装细胞的ep管*好插在冰上,拿着冰盒。
流式细胞术是分子生物学、生物化学和**遗传学中常用的一种实验方法。本公司由海外华侨和多名海归博士组成的技术团队,主要致力于**学、分子生物学、病理学、代谢组学、生物化学技术在科研中的应用与推广,专业从事医学科研课题外包,项目申请、组织实施、检查评估、验收鉴定等服务。有着十分丰富的科研经验和实战技术,所以值得选择,以上信息仅供参考,详情请致电相关工作人员为您解答。
我们的愿景:巩固华联科在医学生物学实验操作上的优势地位,更好的服务广大科研工作者。我们的宗旨:持续关注客户需求,持续提高我们的能力,持续发挥实验助手的作用。我们的质量方针:客户的满意是我们服务的金标准。