1、如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损? 建议血清应保存在-2O℃。若一次无法用完一瓶,无菌分装血清至恰当的**容器内,再放回冷冻。将血清从冷冻箱取出后,置于2~8℃冰箱使之缓慢融解,一般是融解过夜。
2、血清中包含絮状沉淀,它们是什么,怎么处理? 沉淀主要成分是纤维蛋白和脂蛋白,不会影响血清品质。 首先让其沉淀在瓶子底部,中上层无沉淀血清直接转出使用,下层血清装到50ml无菌离心管,400g,离心3分钟即可除去 (一般不建议采用过滤的方法除去沉 淀,因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤)。
3、实验室如何选择适合的血清? 稀有的澳洲血清培养娇贵细胞(小鼠ES、原代细胞分离培养),南美血清或国产胎牛血清用于癌细胞、常规细胞系培养(用量*大),新生牛血清用于病毒包装(构建稳转细胞株)。
4、微生物培养基中添加了血清和***后,可长期保存吗? 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和***时,您应该在两周内使用它。因为一些***和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。
5、有必要做热灭活吗? 实验显示,经过正确处理的热灭**清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。 若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量!
6、细胞培养中出现黑点是污染吗?如何处理? 一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成,首先,要肉眼观察微生物培养基是否混浊,然后,在镜下观察培养细胞生长的状态,黑点是否游动。如果细胞被污染,微生物则会大量繁殖,微生物培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括**污染、支原体污染等。 如果在镜下观察细胞,生长状态良好,与黑点出现前相比,没有任何变化,那么,黑点的出现可能与以下几种情况有关:
(1)细胞生长过老,破碎的细胞残骸;
(2)血清质量不好,反复冻融的结果;
(3)配制培养基的pH值偏高,不宜细胞生长;
(4)培养原代细胞中出现小黑点,可能是原代组织中的杂质,多次传代可以消除。
7、EDTA在细胞消化过程中起什么作用? EDTA是一种螯合剂,它可以螯合Ca2+ 或Mg2+,而细胞表面很多和培养皿或培养瓶结合的蛋白都是带有Ca2+ 或Mg2+的,把这些离子螯合后,可以加速细胞和培养皿的脱离,促进消化。上皮类细胞的连接存在“桥粒”结构,是细胞间*“牢固”的连接,但桥粒的形成依赖于钙离子的存在。在胰酶消化细胞时,加入EDTA,可以破坏细胞的桥粒结构,使细胞能够分散成单个细胞。通俗地说,就是破坏细胞间的粘连。
8、如何选用特殊细胞系培养基? 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。优选DMEM做贴壁细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养。另外还可以参考ATCC网站的推荐信息。
9、 怎样让细胞适应新的条件? 从原条件逐渐过度:1/4、1/2、3/4,*后是完全新培养基。
10、为何微生物培养基保存于4℃,颜色会偏暗红色?
(1).培养基内之CO2会逐渐溢出,造成微生物培养基越来越偏碱性。颜色也会随碱性增加而更偏暗红。
(2).培养基偏碱之结果,将造成细胞生长停滞或死亡。需调整pH值至7.0~7.2. 11、细胞冻存管应如何解冻? 37℃,1~2分钟内全部融解。 冷冻管建议放在液氮液面上面,由液氮桶中取出解冻时,必须注意**(戴护目镜),预防冷冻管之爆裂。
12、细胞冻存管应如何解冻? 可能原因:
(1)胰蛋白酶消化过度
(2)支原体污染
(3)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当
(4)细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)
(5)接种细胞起始浓度太低或太高 解决办法: 1. 准备一个培养容器,内装合适体积的适宜培养基,并使其温度和pH与建议的相称 。 2. 在37℃或该细胞系正常生长温度水浴下通过轻柔摇动迅速溶解冻存管(约2分钟); 3. 管中内容物溶解后立刻将冻存管移到超净工作台内,并用70%酒精**表面防止污染,注意无菌操作。 4. 拧开冻存管盖,将管中内容物转移到已装有少量培养液的无菌离心管中稀释,离心(一般125g,10分钟),弃去上清并用1~2ml完全培养基重新悬浮沉淀细胞,然后转移细胞悬浮液到培养容器内混合均匀。注意:如果冻存液中含5% DMSO,则不必离心,只需用15ml培养液悬浮即可。因为DMSO在这个浓度时没有毒性。 5.24小时后检查培养情况,如果需要的话进行扩传。有些细胞系(比如杂交瘤细胞)从冻存状态恢复需要几天时间。 实际上,一些杂交瘤细胞在**天培养液中出现死亡细胞并产生许多细胞残骸。许多细胞冻存后活力下降并在融化后24小时到一个*低状态。此后细胞将恢复并进入对数生长期。细胞复苏过程不是很难,主要是速溶这步很关键。再有,细胞复苏的状态如何,较大程度上取决于细胞冻存时的操作。还有一点,细胞也是有思想的,你对他好,关心他照顾他,他也不会让你失望的。
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