**组化染色标记因利用抗原抗体结合的原理,而使其具有特异性强、准确性高、可靠性大的特点。但是在实际病理工作中,**组化染色假阳性还是存在的,只有消除假阳性,病理诊断才能更准确。
一、消除非特异性背景着色
1、非特异性着色*常见的情况是蛋白质(抗体)吸附到组织切片中高度荷电的胶原及结缔组织成份上。
防止非特异性背景着色的方法:滴加一抗前,在标本上加一种无关的蛋白质溶液,封闭荷电点不给一抗留有吸附余地,以保证一抗不会吸附到胶原纤维及结缔组织成份上。*常用的无关蛋白质溶液是所用二抗的同种动物非**血清。用产生二抗的同种动物血清,是为了避免二抗与预先加入的蛋白质结合引起假阳性染色。
2、红细胞破裂会使其中的过氧化酶与底物作用,产生非抗原特异性的阳性着色。
防止非特异性背景着色的方法:用来阻断非特异性结合的血清不能有任何溶血现象,多克隆抗体因其成份复杂,更易造成背景染色。稀释液采用含1%BSA pH7.4的PBS,同时在洗液中加入0.05%的吐温20(Tween20)有助于消除背景染色。
3、另外还有动物脏器粉末吸收法、透析法、葡聚糖凝胶G-50柱层析法、DEAE纤维素柱层析法、荧光抗体稀释法、纯化抗原法等多种有针对性方法消除非特异性背景染色。
二、消除内源酶的影响
1、在涉及**过氧化酶的各种染色中,均用过氧化物酶来标记抗体,酶的作用是催化底物,使显色剂显色,正常组织中也含有一定量的过氧化物酶,其同样也能催化底物显色,从而影响**组化染色的特异性。
方法:需要在加入标记酶前将内源性过氧化物酶灭活,以保证染色反应的特异性。一般,先用3%的过氧化氢溶液作用,但在含有丰富血细胞的标本中,由于血细胞中存在大量具有活性的过氧化物酶,能与过氧化氢产生强烈的反应,产生气泡而破坏组织结构和细胞形态。在OCT包埋的冰冻切片中,使用3%的过氧化氢化溶液亦会产生类似现象。此时可用3%的过氧化氢甲醇溶液孵育20分钟的方法灭活内源性过氧化物酶。
2、灭活内源性过氧化物酶对正确判断含血细胞较多的标本,如骨髓、胎盘、脾等的染色结果十分重要。同样,正常细胞也含生物素,尤以肝、脾、肾组织中的含量为多。在应用亲和素试剂的染色中,内源性生物素易结合后继抗体,形成亲和素(或链亲合素)-生物素复合物,导致假阳性发生。
方法:采用生物素方法染色前,对标本进行亲和素处理,使其结合位点饱和。
三、防止切片制作不当引起的非特异性着色
在严重变性、坏死及炎性病灶处,在胶原纤维和结缔组织部位,在切片裱贴不平、折皱处以及组织边缘部位常会出现非特异性着色。其中有的是因组织荷电状态改变而吸附抗体,有的机理不明,有的可能与组织边缘或皱折深部的槽形构型有关。
方法:滴加一抗前,以二抗动物的正常血清(5—10%)封闭、饱和电荷吸附位点和改善取材与制片技术。
四、消除抗体导致的非特异性着色
1、抗原不纯而导致制备的抗体不纯,常见于多克隆抗体。
方法:用亲和层析的方法除去非特异性抗体或应用高纯度的抗原制备抗体,采用单克隆抗体能避免非特异着色。
2、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇。
方法:采用针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体。
五、消除病理性色素的影响
1、所检动物由于出血等原因造成吞噬含铁血黄素细胞增多,与DAB显色呈现的黄褐色发生混淆。
方法:选用AEC显色剂。
2、组织固定时间过长时,切片容易产生福尔马林色素颗粒,影响结果观察。
方法:取材时充分用流水冲洗,以消除影响。
六、消除DBA显色产生的某些背景颜色
1、使用浓缩型DAB试剂盒时操作错误,另外粉剂DBA溶解时,为过滤除去一些不可溶性颗粒,产生斑点状着色。
方法:使用浓缩型DAB试剂盒时请严格按照说明书标明的滴加顺序操作,注意校正蒸馏水的pH值。
2、DAB保存不妥,导致产生氧化物,沉积于切片上。
方法:DAB保存于避光干燥处,现用现配,临用前加过氧化氢。
七、充分清洗
清洗不充分会造成的非特异性着色,从而造成假阳性。
方法:缓冲液中含一定量的盐,其有利于减低背景着色,通常使用0.05mol/L PBS,溶液内加入吐温20效果更佳。特殊标记时。另外,在清洗后至加入下一步试剂前不能干片,因为干片的部位会出现非特异着色。