DNA片段。主要过程是,通过合成的一小段单链DNA片段(引物)与模板DNA特定的区域特异性的结合,以dNTP为底物,通过DNA聚合酶沿着引物和模板形成的双链部分的3’端聚合形成DNA片段实现DNA体外扩增的过程。
在PCR的过程中,一般常会遇到以下几种异常情况,下面是对异常情况进行的分析及处理。
1 PCR结果假阴性,扩增无条带
大家在PCR过程中常常会出现电泳后无目的条带的情况,其影响的主要因素可能有:
l 模板DNA的制备
当模板中含有蛋白、Taq酶抑制剂(如残留酚、氯仿等)或者DNA模板变性不彻底都会导致PCR扩增不出条带,这里推荐大家采用酚氯仿抽提DNA的经典方法,但是在吸取上清的这步骤时,必须要小心操作;
l 引物的特异性
引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,都会是PCR失败或扩增条带不理想的常见原因。所以需要选择一家好的引物合成公司,同时对于引物的浓度,除了看OD值外,还可以对引物原液进行琼脂糖凝胶电泳的方法进行检测质量好坏,而在使用引物的过程中大家可以将引物分装多份,防止反复的冻融,导致引物降解失效;
l 酶的质量
主要的原因可能是酶由于存储不当导致失活,可以考虑更换新酶或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性;
l Mg2+浓度
镁离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过低会影响PCR扩增的产量或扩增不出条带,出现假阴性的情况;
l 靶序列
如靶序列发生缺失或突变,会影响到引物与模板的特异性结合,也会造成PCR扩增不成功的情况;
2 PCR结果假阳性,出现的PCR扩增条带与目的条带一致,有时其条带更整齐,亮度更亮,而且空白对照也有条带。
l 引物设计不合适
选择扩增的序列与非目的扩增序列有同源性,因而在PCR扩增时,扩增产物为非目的性的序列。
l 污染
靶序列与扩增产物的交叉污染或者空气中小片段核酸的污染,都会造成假阳性的结果。这种解决办法为:大家在操作时应小心轻柔,并防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外,实验所有试剂或器材(除了酶和不能高压的物品外)都应高压**,实验室需定期进行紫外线照射,以破坏空气中存在的核酸。
3 非特异性扩增条带,PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
造成这种非特异性条带的主要原因有以下几种
镁离子浓度过高,过高的浓度可降低PCR扩增的特异性,产生非特异的条带;
引物与靶序列不完全互补,此时需要尝试重新设计引物;
退火温度过低,适当的提高温度可减少非特异性条带的出现;
PCR循环次数过多
4 出现片状拖带,PCR扩增有时出现片状的条带
模板或引物发生降解了的情况,应减少模板和引物的反复冻融,*好是分装后冻存;
引物的特异性不佳,需重新设计引物进行尝试;
Mg2+浓度过高、dNTP浓度过高、退火温度过低、循环次数过多或者酶的用量过多都会造成影响,在非特异性产物过多时都会出现拖尾的情况,需要对体系中的成分及程序进行重新摸索调整.