lncRNA 的研究已经在世界范围内变得越来越热门,通过这些年的研究,lncRNA的机制研究也形成了一定的套路:
1)高通量分析lncRNA的表达;
2)验证高通量筛选后的结果;
3)研究lncRNA与蛋白之间的相互作用。
lncRNA研究策略和技术方法
(1)高通量分析lncRNA 的表达
随着lncRNA研究的不断深入,现在已经有了很多很成熟的lncRNA芯片产品,可供选择。另外二代测序的兴起,也使得RNA-seq成为分析lncRNA表达谱的有效手段。从费用的角度讲,lncRNA芯片的价格较二代测序RNA-seq便宜很多。
应用lncRNA芯片或者RNA-seq进行lncRNA表达谱分析的研究已经有了很多。例如,Orom等人在人类的细胞系中通过lncRNA的芯片筛选,鉴定了3019条lncRNA的表达分布。另外,Ng等通过定制化的lncRNA芯片(customized microarray)研究了人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESCs)内的lncRNA表达谱(expression profile)。他们发现有一些胚胎干细胞特异性的lncRNA对于维持干细胞的多能性(pluripotency)有非常重要的作用。在肿瘤研究(乳腺癌、胰腺癌、肝癌等)中,lncRNA芯片的应用也是非常地广泛。
相对于lncRNA芯片在表达谱研究方面的广泛应用,RNA-seq方法的应用领域则明显地不同。RNA-seq 主要用于研究转录组。应用该方法,获得的结果受到的干扰信号(background signal)比较低,更重要的是,通过RNA-seq有可能获得全新的转录产物(当然包括lncRNA在内,但是不局限于lncRNA。例如在肿瘤研究中,常用RNA-seq去发现新的融合基因。利用RNA-seq技术,研究人员发现某些lncRNA分子在神经精神**(neuropsychiatric disorder)中发挥重要作用。另有研究者通过RNA-seq技术,分析了肝细胞癌(HCC)中的整个转录组,当然也包括了lncRNA。
(2)对于高通量数据的验证
常用的验证高通量数据的实验手段有:Northern blot、qRT-PCR、FISH及RNAi 等方式。
目前*为常用的检测lncRNA表达的手段是qRT-PCR,它的操作简单,自动化程度高,在实验室普遍使用。FISH的实验方法,使用的实验室就相对较少。FISH和Northern 类似的地方是,它同样是基于分子杂交的原理。使用FISH的一大优势是,它不仅可以表征lncRNA表达量的多少,更可以直观地告诉研究者lncRNA在亚细胞/组织中的定位。
研究者成功地使用该方法研究了多条lncRNA,包括Xist、MALAT1、MENε/β和Kcnq1ot1等。RNAi是另一种广泛使用的实验手段,在细胞中特异性地敲减lncRNA,是检测lncRNA功能时,*常用的实验方法。例如,HOTAIR的5'区域和3'区域可以分别结合PRC2和LSD1,并起到一个脚手架(Scaffold)的作用。研究者通过RNAi的方式,敲减细胞内源性HOTAIR分子,证实了该分子在结构上的作用和功能。需要注意的是,以上的多种方法可以相互结合,以验证筛选获得的lncRNA的表达及其可能发挥的功能。
疑惑解答:
(1)lncRNA*常用的套路有哪些?
答:常用的套路有两种。一种是移植性研究(me too study)。直接把在其他肿瘤中已经研究过的lncRNA分子拿来,在自己的研究体系中加以验证。这类文章是很难上高分的;**类是通过筛选。常用的筛选有两类:芯片和RNA-seq。相对而言芯片便宜些,但是只能在已知的分子中筛选具有差异表达的分子,RNA-seq 太烧钱,但是能发现新的分子。
(2)使用包含lncRNA和miRNA的芯片是否合适?
答:一张芯片上同时包含miRNA和lncRNA,甚至还包含mRNA及SNP等多种类型探针的芯片,被称为嵌合芯片。这类芯片通常情况下,检测的范围很广,但是检测的重复性并不能让人满意。至于是否要采用嵌合芯片,取决于实验目的。但是相对而言,同时检测lncRNA和mRNA是常见的,但是同时检测lncRNA和miRNA非常地少见。
(3)lncRNA的siRNA靶点预测怎么选?
答:针对lncRNA的siRNA靶点预测,目前还没有特别有效的工具。只能靠运气和人品进行。相对省钱的方法是,先化学合成siRNA进行筛选,有效的siRNA再进行病毒包装。
(4)做筛选需要选用多少对样本?
答:理论上,三对样本就足够(一对样本指同一个病人的癌组织和癌旁组织)。但是为了筛选效果的可靠性和可重复性,建议*好6对样本或以上。当然,如果是土豪,那么the more the better.
(5)样本如何保存?
答:用于RNA研究的样本保存,*重要的是两点:1)快速;2)低温。我们的方法是,学生拿着液氮罐等在主刀医生旁。一旦获得样本,立即放入液氮罐以防止降解。