LIPOFECTAMINE 2000转染细胞注意事项及常见问题解答：
1. 细胞的状态，这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于*佳的生长状态再做。一般细胞复苏后的3代左右细胞状态*好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。
2.细胞的融合度，说明书上写的细胞的融合度要达到90%才能做啊，你的才70%，细胞太少，肯定容易死的。建议接种密度是3~4*105/ml.
3.无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有无血清培养基的话，就用它代替PBS洗细胞两遍。注意洗的时候要轻，靠边缘加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，当然加了脂质体，细胞受影响就更大了。
4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。18小时毒性时间太长了！
5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内**。浓度不要低于0.35ug/ul。
不知道你用的是不是invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000，感觉你的方法无论是几孔板的体系都跟我的一点都不一样啊！以下是以6孔板为例说明一下操作实验体系：
• 溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul LIPOFECTAMINE 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）
• 溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）
• 将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
• 无血清培养基冲洗细胞两遍后加入2ml 无血清培养基。
• 将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中保温24-72小时。
• 48小时mRNA表达*高；72h蛋白表达*高。
脂质体2000转染293ft细胞注意事项及常见问题解答：
293细胞 总有一种转染方法适合你！
问： 我用LIPOFECTAMINE 2000转染 293ft细胞，细胞老是死亡，是什么原因?
Day 0：细胞传代后计数、seed 2.0x105Cell s and 1.0x106 cells per well of plate
Day 1：细胞达到70%汇合后准备:溶液1：200ul 无血清培养基 + 4 ul LIPOFECTAMINE 2000per well
溶液2：200ul 无血清培养基 + 1 ug GFP per well
将溶液1与溶液2混合，室温下置30min后加入600ul无血清培养基;PBS 冲洗细胞后每well加入500ul 混合的溶液。
Day 2：18小时后用PBS 冲洗细胞，加入含10%血清的培养基。隔天观察细胞绿色荧光。
但是做到Day 1的时候，即加入lipofectamine后细胞就死亡了，后来老板说可能时间太长了，改18小时为4小时，但293ft细胞还是死亡。
答1：脂质体量多了,我们用说明书上的一半量,效果很好,但是质粒 要先测浓度.还有可能是时间久了,一般4-6小时后就要到掉脂质体,换为有血清和双抗的培养基，并且要用**抗血清的培养基孵育lip5分钟以上
答2：建议用磷酸钙系统转染.通常293都是用该系统转染的,且效率很高,但要注意防止污染.2005年的Nature methods上有经典步骤.祝顺利!
答3：我个人也碰到类似的情况，曾与INVITROGEN的技术支持反映过此问题，对方的回应【原始邮件没有找到】认为主要是lipo2K的毒性问题，其中特别强调了：
1. 取LIPOFECTAMINE 2000时，一定要将LIPOFECTAMINE 2000轻轻混匀，以确保你吸取的LIPOFECTAMINE 2000浓度是正确的，不会过高或过低。当没有混匀，虽然你吸取的是4ul，但由于你吸取的lipofectamine 2000浓度可能较高，会造成严重的细胞毒性;
2. 细胞密度问题：说明书上建议是细胞达到90%左右汇合时进行，这样可以减少LIPOFECTAMINE 2000的毒性。如果细胞密度较低，如70%，会造成较为严重的毒性，而使细胞死亡。
同时建议：
1. 由于293的转染效率非常高，细胞生长也非常旺盛，因此，打到95%左右汇合时转染，可能时比较高的平衡点(细胞毒性与转染效率的平衡点)
2. 转染时间4h没问题。
3. 你没有说你是用什么培养板，500ul/well，可能是24well-plate。如果不是，应该按说明书进行，英文版的LIPOFECTAMINE 2000说明书（点这下载）;
4. LIPOFECTAMINE 2000转染时的培养基是可以含血清的，如果上述建议仍然无效，你可以试试，将“转染混合液”加入含有血清的培养基培养的293细胞孔中。【配制转染混合液还是用无血清的，*好是opti-mem。
如果是6孔板，你转染混合液加入的是每孔500ul，这样的体积对6孔板而言，几乎是可以覆盖细胞单层的下限，有可能会造成孔中央的细胞缺乏培养基。因此，建议你还是按说明书的来，2ml/well。
在你没有得到好结果前，要认真按说明书进行，而不要根据自己的臆想进行所谓的优化实验，更改参数。祝各位老师实验顺利！
